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圖一: circRNA的生成及功能(圖來源: Wilusz, J. E., and Sharp, P. A. (2013). Molecular biology. A circuitous route to noncoding RNA. Science 340, 440–441. doi: 10.1126/science.1238522 )

 

Circular RNAs (circRNAs) 是一種環型的noncoding RNA (ncRNA),早在1991年就有研究發現此類型的 ncRNA,但將近20多年來,人們對於circRNAs的了解依舊陌生,近兩年多篇研究使用NGS RNA-Seq的定序的技術,於哺乳動物細胞中找到大量的novel circRNAs,其研究成果也登上知名的期刊naturescience

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現階段NGSmapping軟體裡,BWA可以說是相當知名的一個。在BWA aln裡有一個參數-n,其程式內部說明如下:

 

Options:

-n NUM    max #diff (int) or missing prob under 0.02 err rate (float) [0.04]

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在2013年底,Nature Method 期刊將單細胞定序選為年度技術。在發育生物學、腫瘤基因體學、生殖醫學等領域,單細胞定序技術已經開始發揮它的威力,為我們帶來許多珍貴的訊息。本篇主要著重於此技術在當前的現況,介紹目前的單細胞分離技術、放大技術、與一些應用的面向。第一部分將先介紹技術的部份,第二部分將整理一些已發表的應用情形。

單細胞定序的流程,大概可分為1. 單細胞分離,2.依照不同的需求放大樣本進行定序。可以參考圖一。

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 圖一 單細胞定序的流程(圖片來源: Single-cell sequencing Vol.11 No.1 | JAN 2014 |Nature Methods)

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在Ion torrent 定序平台中,要定序之前,要先做出成功的 emulsion PCR,才有可能有好的定序品質 , 但首先要克服以下情況:

        1.  Micro-reactor 必須有一致的大小 :

emulsion PCR 是利用油滴包覆Emulsion PCR 必須所含的物質,包含Bead、 一條 DNA template、d NTP、DNA polymerase、co-factor 等等。這樣的一個反應油滴我們稱之為 micro-reactor。一般而言,micro-reactor 的大小約在 20-30 um , 這樣的大小已經足以提供 Emulsion PCR 一個很好的反應環境。 micro-reactor 若是太大,就會容易造成 polyclonal 的形成 ( 即一個micro-reactor 裡面含有兩條不同的 DNA template,使同一個bead上會有兩種不同序列的 template,造成定序時判讀微弱或混亂 )。

micro-reactor 也不能太小,太小的反應空間雖然可以減少 polyclonal 的形成,卻會使一些emulsion PCR 所需的 co-factor 無法存在於micro-reactor 中,使的Emulsion PCR效率減低。

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除了透過Gene Ontology和KEGG pathway來註解蛋白質功能,也可以將蛋白質序列註解蛋白質結構域(protein domain),推測具有生物功能的序列。

InterPro是一個整合多個蛋白質功能註解的資料庫,透過蛋白質或是核酸序列,此工具由EMBL-EBI提供線上服務(http://www.ebi.ac.uk/interpro/),InterProScan可以註解其蛋白質功能,包含Domain, 2nd structure, GO terms, pathway...

只需要輸入蛋白質序列,就可以預期蛋白質功能,這對於非生物資訊人員而言,算是個簡單的分析方法。

 

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    定序技術不斷推陳出新,自諾貝爾化學獎得主Frederick Sanger起,迄今核酸定序之成本、時間與技術,也逐年的縮短與降低。本篇主要介紹半導體對於定序的應用,其中喬納森羅斯伯格(Jonathan M. Rothberg)扮演著舉足輕重的角色,他是位專精於生物領域的發明兼企業家(圖一),同時也是454生命科學公司(454 Life Sciences)的創業者,成功研發焦磷酸測序技術(pyrosequencing),就在羅氏公司(Roche)併購了454生命科學公司的同年,他創立Ion Torrent公司,羅斯伯格本身亦是蘋果公司創辦人賈柏斯 (Steve Jobs) 的推崇者,因而IT Information technology角度捕捉靈感,進一步將半導體微晶片的概念,跨領域的導入定序技術中,不僅在基因定序領域中具有開創新穎性,其所創造的生技經濟效益,更被富比士財富雜誌評選為封面人物(圖二)

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(圖一)

 

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實驗上,我們時常使用 Polymerase Chain Reaction (PCR) 這項技術增幅目標核酸片段,這在建構NGS gDNA 或cDNA library時亦是其中重要的一環,然而實際上,進行 PCR 會因為兩種現象而機率性地產生非預期的結果:第一、在增幅過程中,片段小的 template 會傾向較容易地被放大;第二、經 PCR產生的產物有部分序列相似時,它們會在 annealing 的步驟中發生部份的雜合配對,而在extension 的步驟被 polymerase 延長,進而產生 chimeric副產物。此外,PCR 的過程中有時會伴隨 primer extension 不完整的產物產生,這樣的產物會在前述的部分配對中,在下一個 PCR cycle 繼續的被延長,但產生大小不一的 chimeric副產物。眾多的 PCR protocol 考量到上述現象,會適當地調整步驟,例如:提高 DNA模板的濃度或是降低 PCR 的 cycle 數,然而,當面對模板 DNA 極微量的情況時,就很難避免 PCR cycle 數的增加,而提高 chimera 出現的風險 (圖一、左)。

針對上述傳統 PCR 的弱點,新式的 PCR 方式被開發出現,利用油水不互溶的特性,製作出許多微小的水滴散布在油類溶液環境中,各種序列不同的模板 DNA 分子被隔離分開至各水滴中,每個水滴均為水性緩衝溶液並包含 PCR 過程所需的材料:DNA polymerase、primer、dNTPs,在適當的比例調配下,每個微小的水滴可少至僅含一條模板DNA 分子,使得每個水滴中的 PCR 反應互相不影響,只會忠實的放大同一條模板分子,所有的 PCR 產物平均地生合成且不會再因部分配對的雜合而被錯誤放大,PCR 反應材料不需競爭、也不因酵素催化的喜好性而出現偏向,徹底解決前述傳統 PCR 的問題 (圖一、右)。

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在實驗過程中多多少少會遇到一些問題,例如有兩個分別貼上DNA及RNA標籤的樣品,在實驗過程中標籤都掉了此時該如何分辨?

也許分辨的方法不只一種,但其中一種是可以利用溶液PH值的酸鹼來辨別,首先將兩管樣品分別取出一些加入鹼性溶液中,再去跑膠則就可以判斷出哪一個為RNA。

RNA在鹼性環境下會有不穩定的現象,甚至會產生降解的情況,其原因是RNA 2號碳上的OH基會受到鹼性溶液(OH-)攻擊,而則造成phosphodiester bond 遭破壞而斷裂行成2’,3’-cyclic monophosphate derivative(如下圖),所以在分子生物中PH值是很重要的介面之一。

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為確保育種者的智慧財產權避免侵權事件、檢測作物是否為混合品種與協助追查農產品走私等皆需進行作物品種鑑定,因此良好的鑑定技術將有助於作物品種鑑定。

 

近年來國內已有多個單位透過簡單重複序列分子標誌多型性分析進行作物品種鑑定,以下針對簡單重複序列進行相關說明:

簡單重複序列 (simple sequence repeat) 簡稱SSR,又可稱為微衛星序列 (microsatellite),是一種以2~6個核苷酸為一個 motif 的重複性序列,普遍存在於所有原核與真核生物基因體 (genome) 中。簡單重複序列於單一基因座 (single locus) 具有多重對偶基因 (multiple alleles) 與共顯性 (codominance) 遺傳的特性,此外簡單重複序列motif發生突變的機率相較於基因體的其他區域高,促使簡單重複序列於每個個體間存在著高度的變異性進而造就簡單重複序列成為鑑別度良好的分子標誌。

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什麼是多樣性? 就從微生物當作例子說起吧!

人體的微生物對身體很重要,它們能保護人體健康,調節免疫系統,維護消化系統之運作。2013年興起了腸道環境與疾病相關議題,近期許多期刊上也相繼發表腸道環境(菌相)多樣性與疾病之相關性文獻。2013年6月份《自然Nature》期刊發表一篇文章,提及利用次世代定序儀器分別檢測代謝正常、不正常(血糖控制機能受損)與糖尿病之歐洲女性(平均年齡為70歲)之腸道環境(Gut metagenome)。結果發現,代謝不正常、糖尿病患者之腸道環境與代謝正常之腸道環境非常不同。那些代謝疾病之患者腸道環境改變,雖然腸道內之細菌數量一樣多但多樣性明顯較少。藉此推測,肥胖症、糖尿病與心血管疾病等相關代謝疾病與腸道環境之改變有關連。[1]

同樣地,2013年11月份,《科學Science》期刊發表兩篇[2、3],關於癌症治療效果與腸道環境相關之文章。通常,罹患癌症之患者體力不佳且免疫系統較弱,因此容易受到外環境影響而感染,因此需要藉由抗生素來幫助癌症患者抵抗外環境之感染。但抗生素之使用會影響腸道內菌群發展,而菌群多樣性卻被證實影響著癌症患者接受化療的效果程度。《科學Science》期刊發表兩篇文獻內容皆以動物實驗為模組,結合次世代定序技術檢測腸道環境與癌症之腫瘤微環境的關係,並且指出腸道微生物能夠幫助癌症治療效果。不過,文獻中有提及,這些模組皆作用於動物體上,同時也期望未來在人體試驗上能夠看見署光。

不只腸道環境需要多樣性能夠維持人體健康,人體的免疫系統,同樣也需要多樣性,來維持與調節免疫系統。免疫系統是最了解自體的醫生,當免疫系統發生問題,那麼與免疫相關之疾病當然紛紛出現,因此,若能了解免疫醫生如何診斷與治療人體,那麼疾病也就更容易對付了。早在2009年PNAS[4]文獻發表,利用次世代定序儀器對免疫T細胞接受器( T Cell Receptor,TCR)的特地區域做定序,發現腸癌患者之免疫細胞多樣性比正常人少,免疫細胞的多樣性低及表示功能性較少,即便是免疫細胞總數不變,那麼面對疾病就相對變得難解了。

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臺灣大學TechComm科技共同空間主辦[次世代高通量核酸定序工作坊] ,有勁將於當日分享光學圖譜(Optical Mapping)和基因體序列組裝(Genome de novo Assembly)的分析經驗。工作坊內容包含介紹Optical Mapping 的技術,不需要Cloning、PCR及Hybridization等技術,也不需要任何核酸序列的資料,就可提供高解析度的全基因體之限制酶酵素圖譜,進而瞭解完整的基因體架構。

現場還有專案研究諮商,歡迎有興趣的老師和同學撥空參加,演講相關訊息如下:

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