目前日期文章:201107 (14)

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一樣用一句話去去解釋 mate-paired 和 paired-end 的差異:mate-paired 技術可以讓定序兩端的間隔高達 2k-5k (目前新 kit 可到 10k )。如下圖所示:

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首先我們將 DNA 打斷成長度為 2000~5000bp 的片段,然後將這些片段的尾端給連接起來,因此可以形成一個環狀的 DNA。圖中的紅色和綠色圓點分別代表 DNA 的 5’和 3’端。然後再將此環形 DNA 給打斷,帶有紅色和綠色圓點的區域即為我們最後要定序的 DNA 片段。由上圖可知,mate-paired 的特色除了含有極長片段的資訊之外,也由於經過環形連接,因此其定序的方向也與 paired-end 相反,分別由原始 DNA 片段的內側往外側延伸定序,這在生物資訊的處理時是要特別注意到的地方。

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RNA-seq 是透過次世代定序的技術來偵測基因表現量的方法,在衡量基因表現量時,若是單純以 map 到的 read 數來計算基因的表現量,在統計上是一件相當不合理事,因為在隨機抽樣的情況下,序列較長的基因被抽到的機率本來就會比序列短的基因較高,如此一來,序列長的基因永遠會被認為表現量較高,而錯估基因真正的表現量,所以 Ali Mortazavi 等人在 2008 年提出以 RPKM 在估計基因的表現量。

RPKM 是將 map 到基因的 read 數除以 mapgenome 的所有 read(million 為單位)RNA 的長度(KB 為單位)

 

其公式為:

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Illumina (Genome Analyzer)與Roche (454)皆是次世代定序儀(Next Generation Sequening , NGS ),兩者的基本原理離不開sanger的鏈終止定序法(chain termintin),但是卻有不同的定序原理。

 

 

 

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RNAi 的原理漸漸被了解發現的同時,許多研究病毒的學者很快就嘗試運用這個天然的機制,來控制病毒在寄主體內的複製與發病。由於許多造成嚴重病害的病毒以 RNA 病毒為主,因此在植物病理學上,亦或是醫學上,都曾嘗試過使用 RNAi 的機制,抑制病毒的複製或是表現蛋白。在 Fire Mello 研究中提到過 RNAi 的反應會經由少量的雙股 RNA 觸發,並放大擴散整個效應,而在後續的研究中,逐漸了解這是因為雙股 RNA 被酵素RNase H剪切成為小分子的 RNA 片段,被稱為“small RNA”。這種小分子的 RNA 的反股會跟細胞內的複合物 RISCRNA-induced silencing complex)做結合,進而專一性的降解所有與這些小分子 RNA 互補的 mRNA 序列,使寄主達到如同免疫的效果。

    RNAi 應用在醫學領域治療病毒所引起的疾病,首例是用在治療 HIV 所引起的愛滋病,HIV 是一種 RNA 病毒,但是由於病毒都具有高度的突變性,因此使用專一性高的 RNAi 來抑制不斷改變的病毒核酸有些困難,但所幸 HIV 在人體感染的途徑已被研究得非常透徹,因此科學家們改變策略不嘗試抑制病毒本身的複製或是蛋白質表現,而針對病毒辨識人體細胞膜外側的 CD4CCR5 receptor 作抑制,當體細胞膜不再具有可被病毒辨識的receptor 後,病毒便無法轉移感染健康的體細胞,達到治療的功效。

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1990 年,一群植物生理科學家— Richard Jorgensen 的實驗團隊,嘗試在矮牽牛 (Petunia) 上增豔花朵顏色,而它們使用的策略是現今發展相當成熟的農桿菌轉殖基因技術以及組織培養技術。chalcone synthase (CHS),是一種開花植物形成花青素的化學路徑上,決定合成效率的關鍵酵素,當時,Jorgensen 使用高效能之 35S promoter 來大量表現矮牽牛之 CHS 酵素,他期望能產出色澤更為飽滿的美麗矮牽牛,但結果卻令他萬萬想不到。

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Jorgensen 的研究報告中顯示出,他所得到轉基因矮牽牛,不但花色沒有變深,甚至高達 42% 的矮牽牛出現白化、白斑、白色嵌紋等性狀,這個結果告訴了他一個事實,植物體內啟動了某一種未知機制,不但抑制了他所轉殖的基因表現,也抑制了自己本身該正常表現的CHS 酵素。在當時,這個現象在植物上被稱為共同抑制(co-suppression)。

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一句話去去解釋 single end 和 paired-end 的差異: single end 只讀取DNA片段的一端,而 paired-end 則是讀取兩端。如下圖所示:

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為何要有 paired-end 這樣的技術發明呢?主要的原因在於 illumina 在每一次定序的過程中,最多只能定序到 150bp 的長度。這樣的長度對比於第一代的 Sanger 定序法(約 1000bp )或是同樣屬於 NGS 的 454 定序儀(約 400bp),顯然是短了許多。因此 illumina 發展了 paired-end 的定序,先將 DNA 打斷成固定長度範圍的片段( 200~500bp ),再利用此技術讀取片段兩端的序列,我們即可得到 300bp ( 150x2 )的定序長度。此一技術不僅拉近了 illumina 和 454 之間的差距,也大大的改善了生物資訊的分析。

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前列腺癌是美國癌症比例第二高的癌症,然而,前列腺癌細胞內發生的基因變異卻尚未被完全了解。直到近年次世代定序技術的蓬勃發展,科學家才得以解序癌細胞內的全基因體序列,進而深入探討前列腺癌細胞的癌化機制。

        Michael F. Berger等人在2011年二月發表在知名期刊natureThe genomic complexity of primary human prostate cancer”,其研究團隊以次世代定序平台GA2x解序七位罹患初期前列腺癌病患的癌細胞全基因體序列,研究發現前列腺癌細胞基因體有非常複雜的重組現象,如下圖,例如染色體21內,原本只會出現在紅色區域內的DNA序列卻出現在橘色區域中,而橘色區域的DNA片段也有轉移到紅色區域的情形,除此之外,不同染色體上的DNA片段也有相互交換的情形,例如正常細胞中僅會出現在第21對染色體之橘色區域的DNA序列,在癌細胞中出現在第1對染色體的黃色區域內。另外,下圖也顯示了在正常前列腺細胞內的基因體結構並沒有DNA片段位置轉移的現象。這些結果顯示前列腺癌細胞的基因體內,有著非常高頻率且複雜的重組現象(genomic rearrangements),並且這些重組現象與癌化過程有很大的相關性。
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癌症在台灣是死亡原因第一位,對於癌症的治療,臨床上仍然無法有效的根除,因此,許多科學家皆積極的參與癌症相關的研究,希望能找出有效的治療方法。了解細胞的致癌機轉,揭開癌細胞全基因體序列,進而了解癌細胞的基因結構是相當重要的。早期以Sanger定序全基因體序列需耗費相當龐大的人力及花費,因此難以對於癌細胞的全基因體定序,直到近幾年,次世代定序技術的成熟,各種癌症的全基因體序列才得以被定序完成,下圖為近年來被完整定序的癌症種類。

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藉由比較癌細胞與正常體細胞的全基因體序列,可了解癌細胞在全基因體上的變異,進而協助科學家找出致癌的機轉及抑制癌細胞的治療方法,下圖為次世代定序配合生物資訊分析找出癌細胞上基因體變異的情形,其中包含point mutation、insertion and deletion(INDEL)、copy number alterations及translocation,另外,如果有部分片段定序出來的序列與資料庫中病毒或病原菌的序列相同,則可辨別細胞被外來微生物感染之病毒或細菌之種類。

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致病性微生物的來源管控及監測對於預防群體感染是相當重要的,傳統上須藉由比較微生物基因體結構上的相似度來找尋感染的源頭,常見的分子檢測方式為PFGE。Optical mapping能在短時間內得到微生物的全基因體限制酶切位圖譜, 因此,在比較不同來源微生物的基因體結構上,能得到比PFGE更精確且詳盡的資訊。目前Optical mapping在管控致病性微生物上,對於找尋醫院內部集體感染抗藥性金黃色葡萄球菌(Methicillin Resistant Staphylococcus aureus, MRSA)的傳播來源及細菌抗藥基因和毒性基因的分析,皆能提供即時且精確的資訊。

抗藥性金黃色葡萄球菌是醫院院內感染最常見的菌種,免疫力較差的住院患者常一旦被感染後,容易因為敗血症而導致死亡,因此,抗藥性金黃色葡萄球菌在醫院內的感染管控是相當重要的。下圖為以optical mapping找尋感染來源的實際案例,以不同病房內所採集到的抗藥性金黃色葡萄球菌之限制酶切位圖譜,與被感染的患者身上收集到的細菌之切位圖譜做相似度的比較,能準確的找出病人被感染之來源病房,並且得以針對特定病房做消毒及管控,進而達到防止集體感染之目的。

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相較於傳統的microarray方法,RNA sequencing究竟有著什麼樣的優點,讓我們必須讓我們從microarray轉換到RNA sequencing呢?


RNA seq 不需預先知道genome sequence,但Microarray 需預先知道genome sequence才能進行。因此,即便是尚未完全解序完成的物種,RNA seq仍能偵測其RNA的表現量。

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(一)Illumina (Genome Analyzer)Sanger sequencing在定序前製作library過程中,是有極大差異的,最明顯的差異莫過於否需經過細菌進行質體複製。

前者(Illumina System就是指NGS)在製作library完全不需經過細菌進行質體複製就能直接進行定序,以減少錯誤發生率(如圖一)

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而後者Sanger sequencing則是在製作過程中一定需經過細菌進行質體複製才能進行定序(如圖二)

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NGS是目前最新且高通量的定序方法,所謂的NGS是指傳統定序法的改良版,而傳統定序法可以分成兩種來說明之。

 

第一種:Chemical Sequencing

 

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Metagenomics這十年來才發展出來的新學門,主要是透過研究分析環境基因體,進而來描繪環境的代謝特性。

一個完整的環境系統,是由許多種生物組成,這些生物種類包羅萬象,除了肉眼可見的動植物外,還有肉眼看不見的微生物族群,這個族群數量遠比動植物多,包含真核微生物(Eukaryotic microbes)、細菌(Bacteria)、古生菌(Archaea)以及病毒(Virus),然而,百分之99以上的微生物是無法培養的,欲描繪一個真實環境的生化代謝圖譜,最有效的方式就是直接萃取環境中的DNA或RNA加以分析,藉由這些基因體資訊,來對環境有一個全盤性的了解。環境基因體具有高多樣性以及高複雜度,最有名的例子是,Craig Venter從一桶海水中萃取細菌DNA,經過基因體分析後,發現含有150,000,000bp非重複性的鹼基對、1,800個genotype以及1,200,000個過去沒有被記錄過的基因,因此,要描繪出真實的完整的環境基因體特性,需要大量的資料量 (Venter et al., 2004)。為了研究高度複雜的環境基因體,近期發展出兩個學門Metagenomics與Metatranscriptomics;Metagenomics是在DNA的層級,來分析環境基因體;而Metatranscriptomics是以RNA的層級來分析,可以補強Metagenomics不足的部分,除了可以分析各種基因的表現量,還能夠偵測環境中的RNA病毒族群。

早期Metagenomics與Metatranscriptomics實驗流程中,必須將環境的基因體DNA或cDNA轉植到E. coli體內,再進行定序分析,其過程繁瑣而冗長,而且得到的資訊量相對有限 (Trings et al., 2005);現在metagenomics研究,可以跳過繁瑣的分子生物學實驗技術,只需要將環境中的DNA或cDNA,直接進行次代定序(next generation sequencing)。 隨著定序技術的發展,定序資料的輸出量也越來越高,也就能夠呈現基因體真實的樣貌,至2010年,一次NGS定序所能夠得到的資料量已經達到100Gb的等級,因此,面對高度複雜的環境基因體的研究,NGS是最有效率的工具。

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距今十萬年前,尼安德塔人的足跡曾遍及歐洲, 亞洲西部以及西伯利亞,而約在三萬年前,尼安德塔人族群卻忽然消失殆盡,他們為何消失? 他們與現代人是否血緣關係? 這些謎團一直是人類學家們所好奇的問題。

Svante Paabo團隊從三個尼安德塔人的骨骼中萃取DNA (圖一),利用NGS系統將其基因體進行定序,獲得超過4Gb序列資料,將其序列資料與現代人進行分析比較後發現,亞洲, 歐洲以及巴布亞新幾內亞的現代人有百分1-4%的DNA來自於尼安德塔人,而非洲裔的現代人則沒有此現象;12個非非裔(non-Africans)現代人特有的序列中,就有10個是來自尼安德塔人,這暗示著非非裔(non-Africans)的現代人祖先與尼安德塔人有雜交的現象;然而這樣的結果,與1997年Svante Paabo團隊的分析結果相左,主要是因為當時並沒有進行全基因體的比對,單單比對粒線體上的DNA,而粒線體DNA只占人類基因體的極小部分,因此,無法呈現全貌,沒有證據顯示現代人與尼安德塔人的關係;如今,定序技術的進步,使的尼安德塔人的序列得以被完整解開,進而證實非非裔的現代人皆有尼安德塔人的血統存在,這樣的結果已經改寫了人類的演化史。

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圖一 三個尼安德塔人的骨骼,是Svante Paabo團隊取樣DNA的來源。

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