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病毒在生物界扮演著舉足輕重的地位,幾乎所有的生物都能被特定的病毒所感染。而昆蟲同樣對於生物界以及人類非常重要,保護對人類有益的昆蟲,以及研究傳播病害的昆蟲是非常重要的事,例如:保障蜜蜂以及幼蠶的健康、探究疾病媒介昆蟲的帶毒,或是利用病毒製作生物性殺蟲劑等等,都是科學家們努力研究昆蟲病毒的目的。

   在過去,科學家們已花了許多時間研究昆蟲體內所帶的病毒種類,然而,並非所有的病毒都能夠被傳統的實驗技術所偵測到,過去常用在研究昆蟲病毒的技術包括了:直接觀察的TEM、血清學的ELISA、以核酸雜合為主的Southern、Northern blot,也有人直接分析 EST Library 的序列,找出新的病毒,不過這會受限在病毒濃度高的狀況下,後期常見有人使用 Microarray 技術監測如蜜蜂族群的帶毒率,但這項技術受限在只能偵測已知的病毒種類。

   如今,結合上新的次代定序系統,許多在蟲體內的微量病毒都陸續的在過去五年間被檢測到。由於次代定序系統有著快速、相對傳統實驗方式價廉的優點,以及可獲得高通量和正確性高的序列資料,因此即使看不出病徵的染病昆蟲,都能夠被有效的被偵測出微量的帶毒,所以次代定序系統可被用來當作一種監測病毒感染節肢動物們的有利工具。在製備 DNA 或是 RNA 材料時有兩種選擇,可以直接使用所有樣品的核酸製備,或是純化出病毒顆粒後再萃取核酸,後者的好處是可以避免掉寄主核酸的汙染,不僅如此,寄主進食食物上的病毒、還有被導入寄主基因體的病毒基因,都可以避免以減少誤判的可能性。

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  • Nov 25 Fri 2011 09:28
  • FASTA

 當我們需要記錄DNARNA和蛋白質的序列時,我們常用一種稱為FastA的檔案格式。其檔案範例如下:

>Annotation….

ATGCGGATCGATCGA

AAACCCTGA

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Velvet 是 Daniel Zerbin 與 Ewan Birney 提出的一種應用在序列組裝 (assembly) 的演算法,這個演算法是利用一種特殊的序列索引 (De Bruijn graph) 來記錄各條互相配對 read 序列,並且在此索引上依照序列 depth 以及較長序列組裝路徑來處理定序誤差及 repeat 的情況。De Bruijn graph 索引結構的設計特別適合短序列並且索引結構本身並不容易受到 read 序列庫大小而增大,同時還可記錄序列上 repeat 的片段,因此此一演算法大多應用於 Solexa 所產生的序列庫。

新圖片.png  

Velvet 在組裝序列的過程中,先將 read 序列儲存於一張網絡結構 (De Bruijn graph) 以及一張查詢表格中(上圖節錄於原作論文中,是一張非常簡化的網絡)。此一網絡結構主要是將所有 read 片段以固定長度 (K-mer,像是一個 reading frame) 抓取序列下來,單一 read 序列由多個K-mer組成,並在網絡中以一個 base 位移相互並列在一起(也就是上圖傾斜排列的序列)。如果有遇到與其配對的 read,就會把配對的 K-mer 分離出(形成上圖中藍色的區塊),並且將原來鄰近的 K-mer 以一個箭頭連接起來。將 read 序列轉變成上圖的過程中也會將各 read 在 De Bruijn graph 起始位置以及與其它序列配對的資訊記錄在一個表格中。

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在談論eQTL之前,首先要介紹一下它的由來。

 

最早在研究遺傳與性狀時,大多數是根據孟德爾遺傳定律,認為性狀的不同主要是來自於等位基因不同組合所造成,當然,在某些性狀上,我們可以發現確實是如此,但是在一些性狀上卻不是這樣,例如黑貓和白貓交配的後代就可能是灰色、黑白斑,而不會只有黑或白兩種結果,於是有些人開始提出多基因調控一性狀的理論,會被多基因調控的性狀就稱為數量性狀 (Quantitative trait),而參與調控的基因則稱為數量性狀基因座 (QTL, Quantitative trait loci)。

 

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Library construction過程中,DNA及RNA濃度的精準測定是相當重要的。尤其在製備library之前,必須要了解樣品的濃度,才能取出適當總量的DNA或RNA做為製備的原料,若因為濃度偵測的不準確,會導致最後library產物總量不足夠上機定序。目前常見的DNA及RNA濃度測定方法有吸光值測定法、專一性螢光染劑測定法。

 

一.  吸光值測定法

Beer-Lambert law顯示,分子對於特定波長光之吸光程度會隨著分子濃度而有所不同,所以可以藉由測量溶液的吸光程度optical density推估分子的濃度1DNARNA分子會吸收波長260nm的光,所以可藉由260nm的吸光值換算成濃度(如下圖所示)。此測定法操作簡單且快速,但極容易造成量測的不準確,因為若萃取DNARNA的過程中,溶液混有其他也會吸收260nm波長光的物質,常常會造成高估DNARNA的濃度,進而影響後續實驗的進行。

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