目前日期文章:201204 (5)

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之前我們在”跨越定序平台的迷思”一文中提到,同一個library在Illumina的兩個不同定序機台 (Miseq 及 Hiseq2000) 定序的結果並沒有特別的差異。然而,同一樣品在不同 library 製備方法下,會產生出不同的定序結果嗎?

        2012 年 Joern Toedling 的研究團隊以 small RNA sequencing 做了一系列相關的研究,其將老鼠的 ES_XX (embryonic stem cell line female) 及 ES_XY (embryonic stem cell line male) 做為比較的對象,以不同平台的 small RNA library 的製備法處理樣品,並且分析其定序資料,不同製備法配合樣品的資訊如下表。

新圖片 (2)  作者以 pair-wise Spearman rank correlation 分析上表十個樣品間 miRNA reads 數量的 correlation,並且將結果以 heatmap 形式呈現(如下圖)

新圖片 (3)  

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BLAST 是生物學上常用的序列比對工具,隨著BLAST 改版至BLAST+ 後,許多指令的用法已經與之前不太相同,以下就對 BLAST+ 的指令做一個簡單的介紹。

安裝:

首先請到 ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/ 下載適合平台的 BLAST 程式,一般只需要下載tar.gz 檔,解壓縮後即可使用。

 

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Bioperl是一個基於perl程式語言之上的工具箱,他提供數個不同套件來方便生物學家分析生物資訊的資料。當使用perl分析一些檔案時,透過Bioperl僅需要幾行的程式碼就可以擷取出檔案中的各項資訊,節省一些撰寫基本程式碼的時間。儘管如此,使用Bioperl的時候,開發者仍然要相當熟悉perl語言。越熟悉perl的進階用法以及其他perl模組的搭配,越可以用Bioperl作一些變化。在許多已發表的NGS相關分析軟體中,就可以看到Bioperl的蹤影。

 

功能

Bioperl中的許多功能皆使用物件導向的方式來提供,也就是在使用大多功能時皆需要先建立物件才能取得他的功能。在官方網站可以看到常見的基本用法有:

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我們偶爾會聽到客戶方有這樣的問題:「在 illumina 其他平臺上定序的資料是否可以跟 Hiseq 2000 上的資料一起比較?」,這樣的問題其實很微妙。

首先,我們先探討不同廠牌平臺 (illuminaRoche 454) 間的比較能力,由於 Roche 454illumina 平臺的樣品備製方法不同,定序原理不同,在序列取樣上的方式就不同,若直接進行比較,無法得知有差異之處究竟是來自樣本間的差異,還是定序方法上之差異。

但是同一廠牌,不同平臺間的資料是否能比較呢?illumina 為例,由於 Illumina 在製備樣品 library 時的方式固定,並且定序平臺使用的定序策略相近,理論上應該是可以被當作重複性的實驗,為了證明這個平臺相容性的問題,在最近 38 日的 Nature ISME 期刊中,illumia 與美國的一些知名大學教授合作,發表一篇 short communication 比較 Hiseq 以及 Miseq 的定序結果,探討跨越平臺是否會產生定序結果的差異性。

在這篇文章中所研究的主題為探討微生物的族群分布並且使用 Metagenomic 的方式來分析,材料來源分別取自土壤環境或是與寄主相關的口腔、表皮和排泄物,將全部 24 隻樣品平均上在 Hiseq2000 三條 lane 上以及 Miseq 一片 flow cell(一片只有一條 lane),再將這總共四條得到的 pair-end 資料分成 5′3′8 組。上圖 1 挑選出其中 4 組做為代表,比較 Hiseqlanelane 之間、5′3′ 之間和HiseqMiseq 之間定序的相關性。

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NGS 技術近年來協助科學家解開許多以往醫學上無法破解的謎團,其中包含致病分子機轉、感染性微生物特性及流行病學等,也使得科學家對於醫學的治療及預防提出許多新穎的想法,除此之外,在臨床分子診斷技術上,科學家及醫師皆認為 NGS 技術未來勢必可以成為診斷的利器。然而,NGS技術所提供的資訊,在實際臨床上似乎少有病患直接受惠的案例,直到2011年獲得普立茲獎的一篇文章報導以 Exome sequencing 協助醫師解救一名叫做Nicholas Volker的4歲小孩故事1,並且此案例被發表在 Genetics in Medicine 2

Nicholas Volker首先在其肛門附近不明原因地出現許多簍管,使得排泄物不斷湧出,並且出現感染發炎現象,為防止致命性的細菌感染及傷口惡化,醫師對Nicholas Volker做了結腸造口術,期望他的傷口能夠免除自體排泄物的感染,但出乎意料之外的事情發生了,就在結腸造口術的位置出現新的簍管且有嚴重的發炎現象,而這些發炎的區域漸漸地侵襲Nicholas Volker的整個大腸(圖一),使得醫師不得不切除小孩所有的大腸,然而,不久之後小腸也開始出現簍管及發炎的現象,Nicholas Volker的體力越來越糟,若不快速找出病因,尋求有效的治療方法,生命可能不保。

新圖片  

此時傳統的病理切片檢查及免疫學檢查所提供的訊息,僅顯示小孩的病症並非是一般的發炎性腸病 (inflammatory bowel disease),但仍無法知道確切的病因,後來醫師利用 Exome sequencing 技術,分析小孩 exome 中的 nonsynonymous variants,發現小孩的 X-linked inhibitor of apoptosis gene 變異是造成小孩腸子不斷發炎最有可能的原兇。有了NGS提供的這個資訊,醫師很明確地為小孩進行骨髓移植,移植後的小孩目前已恢復健康,並且期待長大成人迎接這個美好的世界。

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