目前日期文章:201205 (4)

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科學家們發現在不同環境發現的古生物化石 DNA,其受損降解的情形其實是很類似的,使用次代定序的平臺研究古代 DNA 能夠直接的檢測許多現象,為人熟知的例如:嘌呤丟失作用 (Depurination)、胞嘧啶的去胺基作用(Cytosine deamiation)fragmentation rate……等等。

   圖一是研究人員將始祖馬的次代定序所獲得的讀序,比對回現代馬基因體後所做的統計分析結果,觀察發現古生物 DNA 時常斷裂在嘌呤 (GuanineAdenosine) 的後方 (Y 軸標示 -1 位置),也因此讀序的第一個鹼基 (Y 軸標示 +1 位置) 有較高的機率出現嘧啶 (CytosineThymine ),這一項證據似乎可以證明嘌呤丟失作用 (Depurination) 對於 DNA 斷裂降解的影響。

圖一

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NGS 的高輸出量特性,帶給基因體學研究上的突破,然而,目前技術仍有存在一些缺陷,其中最令人詬病的點是定序深度不均勻,造成 NGS 必須提升定序深度,來彌補定序深度不均勻的問題。造成定序深度不均勻的原因很多,其中最明顯的就是序列 AT 或 GC bias 造成,往往 high AT 或 high GC 的區域很難得到滿意的定序品質與定序深度;有一部分的原因很可能是 library 製備過程中造成的,一般 NGS DNA library 製備流程包含,fragmentation、end repair、A-tailing、adaptor ligation、PCR 等步驟,製備流程中,所有的環節都有可能會造成bias,當然包含每一個純化的步驟。為了釐清到底是哪一步驟造成,Aird 團隊利用 QPCR 來檢驗 library 製備流程產生 bias 的情況 (Aird et al. , 2011),結果整理於圖一,縱軸是序列的數量,橫軸是 GC content 的百分比。由圖一可以清楚地觀察到,library 製備的流程中,PCR 過程是造成 bias 的主要原因 (圖一);而 fragmentation、end repair、A-tailing、adaptor ligation 等步驟,不太會產生 high AT 或 high GC 的區域定序深度下降的問題。

圖一

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要讓定序深度更加平均,從 PCR 步驟進行改良將是最有效率的。當然製作 PCR free 的 library 一定是最有用的方式,除此之外,還有三種方式來改善 PCR 造成的問題:

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當我們進行 miRNA 定序時,有時我們會發現有一些 reads 沒有辦法 map miRBase 中的miRNA 序列,那這些 reads 究竟是什麼呢?

由於在樣本備製時,是以 size selection 來決定要定序的 RNA ,只要 RNA size 是落在我們所設定範圍內,都會被定序到,所以這些無法對到miRBase RNA ,有可能是其他的 small RNA ,也有可能是 degrade RNA,當然也有可能是 Novel miRNA

我們該如何判斷得到的 reads 是屬於 Novel miRNA,並知道此 Novel miRNA hairpin 的位置與序列呢?

首先,我們要先有我們所研究之物種的 genome sequence

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當我們想要研究一個物種,可是卻發現這個物種的序列資料 (DNA or RNA) 並不存在於世界上現有的資料庫。當我們遇到這種情況,便可以利用 NGS 的資料來進行所謂的 de novo assembly,藉此幫助我們獲取此物種的序列內容。而一個常見的 de novo assembly 流程概念如下:

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上圖表示將 NGS 的定序資料隨機抽取出兩條 reads (紅色線條),觀察此 reads 的尾端序列是否相同。如有某區域相同(藍色序列),則將此區域的序列合併連結起來,最後獲得一條更長的序列。透過這樣不斷的重複尋找,最終我們便可以將 reads 的資料還原回 genome 序列。

上述的過程是一個理想狀態,然而事實上有許多因素會造成我們組裝困難,我們將這些因素條列如後:

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