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科學家們發現在不同環境發現的古生物化石 DNA,其受損降解的情形其實是很類似的,使用次代定序的平臺研究古代 DNA 能夠直接的檢測許多現象,為人熟知的例如:嘌呤丟失作用 (Depurination)、胞嘧啶的去胺基作用(Cytosine deamiation)fragmentation rate……等等。

   圖一是研究人員將始祖馬的次代定序所獲得的讀序,比對回現代馬基因體後所做的統計分析結果,觀察發現古生物 DNA 時常斷裂在嘌呤 (GuanineAdenosine) 的後方 (Y 軸標示 -1 位置),也因此讀序的第一個鹼基 (Y 軸標示 +1 位置) 有較高的機率出現嘧啶 (CytosineThymine ),這一項證據似乎可以證明嘌呤丟失作用 (Depurination) 對於 DNA 斷裂降解的影響。

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NGS 的高輸出量特性,帶給基因體學研究上的突破,然而,目前技術仍有存在一些缺陷,其中最令人詬病的點是定序深度不均勻,造成 NGS 必須提升定序深度,來彌補定序深度不均勻的問題。造成定序深度不均勻的原因很多,其中最明顯的就是序列 AT 或 GC bias 造成,往往 high AT 或 high GC 的區域很難得到滿意的定序品質與定序深度;有一部分的原因很可能是 library 製備過程中造成的,一般 NGS DNA library 製備流程包含,fragmentation、end repair、A-tailing、adaptor ligation、PCR 等步驟,製備流程中,所有的環節都有可能會造成bias,當然包含每一個純化的步驟。為了釐清到底是哪一步驟造成,Aird 團隊利用 QPCR 來檢驗 library 製備流程產生 bias 的情況 (Aird et al. , 2011),結果整理於圖一,縱軸是序列的數量,橫軸是 GC content 的百分比。由圖一可以清楚地觀察到,library 製備的流程中,PCR 過程是造成 bias 的主要原因 (圖一);而 fragmentation、end repair、A-tailing、adaptor ligation 等步驟,不太會產生 high AT 或 high GC 的區域定序深度下降的問題。

圖一

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當我們進行 miRNA 定序時,有時我們會發現有一些 reads 沒有辦法 map miRBase 中的miRNA 序列,那這些 reads 究竟是什麼呢?

由於在樣本備製時,是以 size selection 來決定要定序的 RNA ,只要 RNA size 是落在我們所設定範圍內,都會被定序到,所以這些無法對到miRBase RNA ,有可能是其他的 small RNA ,也有可能是 degrade RNA,當然也有可能是 Novel miRNA

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當我們想要研究一個物種,可是卻發現這個物種的序列資料 (DNA or RNA) 並不存在於世界上現有的資料庫。當我們遇到這種情況,便可以利用 NGS 的資料來進行所謂的 de novo assembly,藉此幫助我們獲取此物種的序列內容。而一個常見的 de novo assembly 流程概念如下:

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