目前日期文章:201208 (6)

瀏覽方式: 標題列表 簡短摘要

NCBI、GenBank等序列資料庫的開放性使許多人的研究如虎添翼,特別是那些早被定過千千萬萬條序列的模式物種,各種基因的序列、註解與表現量資訊皆可信手拈來。反之,以往非模式物種的研究者卻常常必須使用痛苦指數很高的工具如degenerate PCR除草開路,或是在經費限制下使用表現序列標幟(Expressed sequence tag, EST)取得所需的序列資源。

 

但EST library的資訊量依舊有限,雖然能比較部分基因表現量的差異,卻會忽略掉許多表現量較少的基因。現在,你能選擇使用次世代定序儀建造自己的transcriptome sequence database,讓所有有興趣的序列信手拈來。有篇文獻正好說明這麼做的好處。

20120828_pic1

YourGene 發表在 痞客邦 PIXNET 留言(0) 人氣()

    DNA 的甲基化現象 (DNA methylation) 是表觀基因體機制 (epigenetic mechanism) 中的一種,其對於真核生物基因調控而言是非常重要,真核生物基因的 5’ 端,常可見到高密度的雙鹼基 C-G 存在,其被稱為 CpG islands,而其中大約有 2-7%的胞嘧啶 (Cytosine),藉著 DNA 甲基轉移酶 (DNA methyltransferase) 作用下被甲基化。另外,在原核生物中,DNA 甲基轉移酶主要的功用是用作保護自己 DNA的手段,以避免遭受內生的限制酶剪切,而利用限制酶對付外來侵略性的 DNA,而在真核生物中,也有藉由 DNA 甲基化來避免 retrovirus 表現的防禦機制被報導過,但無論如何,最主要的功能還是在於調控基因表現為主。

    研究 DNA methylation 現象的實驗方法有許多種,包括重亞硫酸鹽 (bisulfate) 和非重亞硫酸鹽 (non-bisulfite) 的方法,在樣品處理重亞硫酸鹽的部分,胞嘧啶(Cytosine) 會脫去胺基變成尿嘧啶 (Uracil),但是被甲基化的胞嘧啶不會被改變,經 PCR 放大之後定序,比對原有參考物種序列,可以知道哪些胞嘧啶發生了點突變,沒有突變的胞嘧啶,有可能就是被甲基化的候選,在非使用重亞硫酸鹽的方法中,主要是使用對甲基化敏感的限制酵素來當作工具,隨後搭配AFLP (amplified fragment length polymorphism) 技術來做研究。

    2008 年,致力於開發 Optical mapping技術的 Schwartz 團隊,發表一篇利用這項技術來研究DNA 甲基化現象的期刊,他們首先在 E. coli 上做測試,當發現這項結合可行之後,將頭腦動到真核生物中,同樣被熱門研究的人類染色體上。在真核生物上進行 Optical mapping 時,較於原核生物容易出現一個問題

,即是不一定有能製造出足夠切位的限制酶,當電腦分析切位不足的單分子 DNA 影像時,無法轉換成鑑別性高的條帶 (barcode) 資訊,因此會面臨片段重組上的難題。在他們進行人類第九號染色體DNA 甲基化現象研究時,嘗試使用 2 種以上的限制酶來克服上述的問題,一種是在非重亞硫酸鹽研究方法中提到對甲基化敏感的限制酶:EagI (C^GGCCG),另一種是辨識切位完全與前一種不會重疊、對於 CMepG 甲基化不敏感、用來製造條帶資訊的限制酶:SwaI (ATTT^AAAT)SwaI 在人類基因體序列中,按照電腦分析大致上能切碎成平均約 15 kb 的片段,而 EagI 在不考慮甲基化情形下,按照電腦分析大致上能切碎成平均約 32 kb 的片段。如同預期的,EagI 的辨識切位可涵蓋了 78%、大約 27,437 個 CpG islands,而其中大約一半的是獨一切位,將這項預測結果搭配上用來製造條帶的SwaI 實際進行Optical mapping 實驗,電腦記錄分析了實際實驗後的結果 (圖一),並組成了一些 contig 片段,再與電腦模擬片段去做平行比較。

YourGene 發表在 痞客邦 PIXNET 留言(0) 人氣()

真核生物rRNA包含28S、18S、5.8S、5S四種rRNA,一般在判斷RNA是否有降解時,會去觀察28S與18S rRNA的狀況,在RNA品質佳的狀態下,28S rRNA總量應為18S rRNA的兩倍左右,如下圖分別為哺乳動物的RNA proflie,

20120817_pic1   


YourGene 發表在 痞客邦 PIXNET 留言(0) 人氣()

之前我們探討了兩種會造成組裝過程產生錯誤結果的因素,這次我們要再來探討第三種因素。

3.重複區域Repeat region

20120810_darren_pic1  

假設我們將NGS的定序資料隨機抽取出三條reads (紅色線條),發現這三條reads的尾端(藍色區域)均有相同的序列,所以藍色區域即為repeat region。當遇到這種情況時,程式會無法判定究竟哪兩條reads應該要組合在一起。但是假如我們使用paired-end reads,即可解決此一問題。如圖示:

YourGene 發表在 痞客邦 PIXNET 留言(0) 人氣()

當我們利用NGS定序儀器所產出的資料格式為FASTQ,細節的說明可參閱之前的介紹(http://yourgene.pixnet.net/blog/post/84563506),其後續的生物資訊分析步驟中,如定序的物種有已知的基因體參考序列,則可將定序出來的short reads針對已知的基因體參考序列做alignment。

 

傳統的alignment分析過程,最常使用的工具就是BLAST(Basic Local Alignment Search Tool),不過由於NGS的技術所產出的資料特點是資料量龐大,序列片段都較短,針對NGS產出的資料如使用傳統的BLAST針對已知的基因體參考序列做alignment是非常沒有效率的。因此在近幾年針對NGS的資料所設計的alignment工具大量的被發展出來。

 

YourGene 發表在 痞客邦 PIXNET 留言(0) 人氣()

現代人長時間生活在辦公室的空間,工作空間裡潛藏了許多的細菌,與我們朝夕相處的細菌到底有多少?有哪些種類的細菌?這些細菌會致病嗎?辦公室的哪些地方有特別多細菌?男生所處的環境真的比女生擁有更多的細菌嗎?           Hewitt的研究團隊在美國的三個不同城市,隨機挑選九十個辦公室,針對每個辦公室裡的椅子、電話、電腦、滑鼠、鍵盤及桌面約13平方公分面積的區域做細菌採樣,而這些辦公室的使用者分別為男女生各半。首先,作者將樣品稀釋後塗在R2A media的培養基上,經過五天的培養,統計樣品內的菌量,結果如下圖所示,橫軸及縱軸代表的意義分別為樣品的來源及細菌的數量,結果顯示椅子及電話上的菌量高於桌面、鍵盤及滑鼠,另外,男性使用的辦公用品得到的菌量比女性的多,而在不同城市的來源上,舊金山的辦公室菌量是三個城市中最低的,上述的菌量的差異作者使用ANOVA分析的確是有意義的差異性。20120803_pic1  

在菌種分析上,由於環境中的細菌組成複雜,無法以培養方式辨別樣品裡面所有的細菌種類,所以作者先將樣品中的DNA萃取出來,以PCR的方式將16S rRNA基因的高度變異區放大,並且將此產物以NGS技術定序,並且分析這些序列以得到細菌的種類。結果顯示這些辦公室用品附有二十種門中超過五百屬的細菌,其中含量最多的為變形菌門(Proteobacteria),其他比例由高至低依序是厚壁菌門(Firmicutes)、放線菌門(Actinobacteria)擬桿菌門Bacteroidetes,不同樣品細菌種類的相對比例圖如下。

20120803_pic2  

 與之前做人體各部位菌相的研究相比較2.3.4,辦公室環境中的細菌種類大多也出現在皮膚及口腔,另外特別的是,部分的種類與在人體的消化道內的菌種相同,辦公室細菌種類中,也有些會出現在土壤裡面的細菌,這些結果可以協助推測可能的細菌來源。

YourGene 發表在 痞客邦 PIXNET 留言(1) 人氣()

找更多相關文章與討論

您尚未登入,將以訪客身份留言。亦可以上方服務帳號登入留言

請輸入暱稱 ( 最多顯示 6 個中文字元 )

請輸入標題 ( 最多顯示 9 個中文字元 )

請輸入內容 ( 最多 140 個中文字元 )

請輸入左方認證碼:

看不懂,換張圖

請輸入驗證碼