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        GATK ( Genome Analysis Toolkit),一套用來分析DNA sequencing data,找尋genomic variation的工具,由Broad Institute開發。目前已被應用在幾個大計畫中,例如1000 genomes projectTCGA(The Cancer Genome Atlas)。而在今年七月也更新成第二版。

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 過去,是利用培養的方式來探究環境中微生物的組成,然而,百分之99以上的微生物是無法培養的 (Amann et al., 1995),因此,80年代發展出非培養的研究方式(cultured independent method),包含T-RFLP、DGGE、SSCP、以及cloning and sequencing的方式來研究環境微生物的族群 (Nocker et al., 2007),以上方式,皆是針對族群共有的目標基因的amplicons來分析,目標基因是依據不同的觀察目標而有所差異,常用的基因有18SrRNA (Eukaryotic microbes)、ITS (Eukaryotic microbes)、Bacterial 16S rRNA、Archaea 16S rRNA、與一些功能性的基因 (如 psbA、psaB、amoA與amoB)。T-RFLP、DGGE、SSCP、以及cloning and sequencing四種方式中,以cloning and sequencing的方式能夠提供最精確的資訊 (表一),然而,在面對高度複雜的環境生態時,必須挑選許多clone去進行定序,才能足以呈現真實的物種組成,例如,至少需要定序1000個clone才能夠呈現沿岸海水的細菌族群圖譜 (Acinas et al., 2004)。

從2006年開始有研究利用目標基因amplicons (如 bacterial V6),直接進行次代定序,即所謂的Amplicons high throughput sequencing,不但可以免除cloning繁複的流程,而且可以獲得大量的序列資訊 (Sogin et al., 2006),以Illumia定序技術定序平台為例,一次可以得到超過100,000,000條序列,這種方式同時擁有高輸出量以及高精確度的特性,因此能夠精確地呈現高度複雜的微生物族群圖譜 (表一)。這種amplicons的定序還能夠配合multiplexing(註一)的方式,讓兩種以上來源的樣品同時進行定序,使的定序更加有效率 (Binladen et al., 2007)。這樣的實驗方式已經被廣泛利用,包含人類共生菌的研究 (Huse et al., 2008 and Hummelen et al., 2010)、海水菌相研究 (Anderssonet al., 2010)以及土壤環境研究 (Chu et al., 2010)。

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       想知道某些環境因子的改變(如:生病的腸子或加了料的海水)會使環境中的某群生物(如:細菌或浮游生物)在群聚結構或基因表現有何反應嗎?20122月的PNAS剛好就有篇paper利用metatranscriptome分析Fe2+離子缺乏的海水加料(阿就是Fe2+離子)後,其藻相與基因表現是如何反應的[1]

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當我們將NGS 資料(reads data)利用各種方法去和參考序列(reference sequence)做比對之後,我們該如何表達比對之後的結果呢?這個問題的答案就是我們耳熟能詳的SAM檔案。SAM的縮寫是Sequence Alignment/Map,它是來自於Heng Li 等人在2009發表在Bioinformatics的文章。藉由標準的SAM檔案格式,我們得以描述每一次比對之後的結果。SAM是一個純文字檔案,可以用任何的文字編輯器開啟,其格式具有以下的優點:

  1. Is flexible enough to store all the alignment information generated by various alignment programs;
  2. Is simple enough to be easily generated by alignment programs or converted from existing alignment formats;
  3. Is compact in file size;
  4. Allows most of operations on the alignment to work on a stream without loading the whole alignment into memory;
  5. Allows the file to be indexed by genomic position to efficiently retrieve all reads aligning to a locus.

 

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近幾年來肺癌成為前十大癌症死亡率最高,原因是現今社會中由於空氣汙染嚴重、二手菸或是因為工作關係長期處在於大型廢氣排放設備的工作區域等等,又加上肺臟本身沒有痛覺神經,所以當發現肺部有異狀時通常癌症已經轉移到淋巴或其他組織。

肺癌與其他癌症的治療方法不外乎就是化療、標靶等等,而近年來國內掀起一陣風潮,就是由基因定序來協助治療肺癌。在2010.09.14的中時健康網(http://health.chinatimes.com/contents.aspx?cid=6,60&id=11649)曾報導過,台北醫學大學附設醫院透過國內外文獻,推出全台首創肺癌基因定序篩檢,癌症患者只要透過基因篩檢就可以找到最適合自己的治療方式或是藥物使用,這樣一來不僅可以對症下藥還可以減少一些治療的時間。在國外早就在2008年Campbell等人在文獻中提利用全基因體定序協助肺癌的研究,接著分別在2010年與2011年陸陸續續都有相關的文獻出爐,如下表

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       真核生物的genome size較原核生物大,且有許多條大小不一的染色體,所以在進行optical mapping及定序資料的組裝上較為困難。若能將真核生物的每個染色體獨立的分離出來,再分別進行定序或解出restriction enzyme map,對序列組裝上會有相當大的幫助。

將不同大小型態的染色體分離出來的技術一直以來都有許多研究團隊在開發,其中的技術包含使用micromanipulator配合雷射切割、使用原子力顯微鏡atomic force microscope nanolithography及流式細胞儀Flow cytometry,其中流式細胞儀Flow cytometry是被認為分離效果較佳的技術。

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