目前日期文章:201604 (4)

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隨著定序價格的降低,以及Illumina定序長度的增加,越來越多人改用Illumina HiSeq或MiSeq平台進行16S metagenomics sequencing。定序所需之library製備方式,也不斷地在改進。以下列出幾種常見的幾種16S metagenomics sequencing之library製備方式,以及各自的優點與缺點。

 

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        16S metagenomic sequencing目前被廣泛運用於微生物族群分析,過去無法被培養、被分類手冊定義的微生物,藉由分子實驗為人類所見,且不需要花費高昂的費用即可達成。藉由生物體中16S rRNA中高保存序列中的物種關聯性,來完整演化樹或完成菌相分佈的輿圖。然而16S metagenomics還無法完全滿足人類的求知欲。一方面16S metagenomics在準確性有其極限 (見測不準的微生物community),且解析度方面亦需要更進一步的技術發展來補足。

  目前能見度愈見增加的Single-cell sequencing是目前被看好的方法之一。簡單而言,藉由fluorescence-activated cell sorting (FACS)將微生物分出,再利用multiple displacement amplification (MDA)對單一細胞進行序列分析,可以僅針對有興趣的微生物族群做進一步的了解。

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BIOM全名為Biological Observation Matrix,其發音同 biome。是一種以JSON (JavaScript Object Notation)格式為基礎,設計出能呈現樣本、其觀察數據以及其他相關資料列聯表的格式。目的是希望能廣泛使用在體學  (Omics)研究上,因Omics研究領域中出現的檔案特性之一為其資料矩陣密度不高(例如:含有大量為零的數值)由於矩陣在程式中常使用二維陣列表示,二維陣列的大小與使用的記憶體空間成正比,如果多數的元素沒有資料,則會造成記憶體空間的浪費。為此,開發BIOM格式作為更適合Omics研究領域的資料型態。

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     Single Molecule Real-Time (SMRT) sequencing發展至今,的確在讀長方面相當優勢 (約 5K-10Kbp),但是在定序價格無法降低的情況下,許多狀況並不合適完全取代次世代定序儀,例如:metagenomics 的定序。近年,10X Genomics 導入這套系統甚至可以產生 50 Kb 組裝後序列,但原理細節對外部並沒有公布,而 Illumina 也增加了一種新的 library 製備方式來獲得近似第三代定序儀讀長的結果,商品名稱為 TruSeq synthetic long read (TSLR) technology。這項技術使用過去 BAC library 這常用來研究物種基因體的觀念,將龐大複雜的基因體切割成許多小部份,只不過每一小部份相較於 BAC,insert 增加至 Kb 以上的單位來做次世代定序。

    目前常見的兩種 Long fragment reads library 製備方式,均不需要真的 cloning放入細菌載體中複製,但會將 Kb 為單位的片段打碎後掛上各自的 barcode,再藉由後端解讀barcode,將定序的資料重新分群後以 Kb 為單位組裝,重現近似第三代定序儀讀長的結果。無庸置疑的,在定序未知物種基因體的 de novo assembly 上相當的有幫助,尤其是能跨越重覆序列 (repeat sequence) 來幫助組裝,除此之外,由於多數物種基因體為多倍型染色體,例如:人類是二倍體 (Diploid) 生物,幾百 base-pair 的讀長有時可能無法正確判斷基因座落在何條同源染色體上,如今,這項技術應用在人類染色單倍體分類 (Haplotyping) 研究,甚至能追溯親代基因型的遺傳。

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