目前日期文章:201604 (4)

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隨著定序價格的降低,以及Illumina定序長度的增加,越來越多人改用Illumina HiSeq或MiSeq平台進行16S metagenomics sequencing。定序所需之library製備方式,也不斷地在改進。以下列出幾種常見的幾種16S metagenomics sequencing之library製備方式,以及各自的優點與缺點。

 

採用 Barcoded 16S rRNA primer & Illumina TruSeq DNA Library Preparation

首先我們須先根據待定序的樣品數目, 設計不同的 16S-barcoded-primer。以16S的V1-V2 region為例,在27F以及338R primer 的5’端加上6-mer的barcod序列 (如下表,粗體底線的部分是barcode序列,其餘則是原本的16S primer序列)。

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        16S metagenomic sequencing目前被廣泛運用於微生物族群分析,過去無法被培養、被分類手冊定義的微生物,藉由分子實驗為人類所見,且不需要花費高昂的費用即可達成。藉由生物體中16S rRNA中高保存序列中的物種關聯性,來完整演化樹或完成菌相分佈的輿圖。然而16S metagenomics還無法完全滿足人類的求知欲。一方面16S metagenomics在準確性有其極限 (見測不準的微生物community),且解析度方面亦需要更進一步的技術發展來補足。

  目前能見度愈見增加的Single-cell sequencing是目前被看好的方法之一。簡單而言,藉由fluorescence-activated cell sorting (FACS)將微生物分出,再利用multiple displacement amplification (MDA)對單一細胞進行序列分析,可以僅針對有興趣的微生物族群做進一步的了解。

  其序列可對應到已知基因及新陳代謝路徑,並提供對於菌系 (strain)變異性的評估證據,準確地完善原先無法被定義的演化樹分支 (Candidate division),賦予鄰近微生物物種原先16S metagenomics所欠缺的生物學及演化學定義。其提供的完整序列所帶來的意義為單單分析16S rRNA所無法提供的。

  Single-cell sequencing所獲得的序列資訊能與其他metagenomic資料及metatrascriptomic資料相搭配,如同同時建構骨幹及血肉,將總體基因分析結果及深度定序資料彼此驗證;另外,由single-cell發展而來的mini-metagenomes亦為目前對於single-cell技術應用的熱門領域,藉由蒐集環境微生物取樣分析,為大環境生物演化的觀察提供良好的視野。

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BIOM全名為Biological Observation Matrix,其發音同 biome。是一種以JSON (JavaScript Object Notation)格式為基礎,設計出能呈現樣本、其觀察數據以及其他相關資料列聯表的格式。目的是希望能廣泛使用在體學  (Omics)研究上,因Omics研究領域中出現的檔案特性之一為其資料矩陣密度不高(例如:含有大量為零的數值)由於矩陣在程式中常使用二維陣列表示,二維陣列的大小與使用的記憶體空間成正比,如果多數的元素沒有資料,則會造成記憶體空間的浪費。為此,開發BIOM格式作為更適合Omics研究領域的資料型態。

而Omics一詞於希臘原文意指一種整體的研究領域,常聽聞的有蛋白質體學 (Proteinomics)、代謝體學 (Metabolomics)總體基因體學 (Metagenomics)近年來可見體學研究隨時間逐漸成長,或發展出各種與體學相關的資料類型。如圖一。因此,將MEDLINE文獻資料庫這些數據,以已知有限的分析方式如無母數統計中的Chao1分析方法。藉此去推測,隨著科技發展進入“ome-omics”新時代後可能會有超過三千種的Omics。

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     Single Molecule Real-Time (SMRT) sequencing發展至今,的確在讀長方面相當優勢 (約 5K-10Kbp),但是在定序價格無法降低的情況下,許多狀況並不合適完全取代次世代定序儀,例如:metagenomics 的定序。近年,10X Genomics 導入這套系統甚至可以產生 50 Kb 組裝後序列,但原理細節對外部並沒有公布,而 Illumina 也增加了一種新的 library 製備方式來獲得近似第三代定序儀讀長的結果,商品名稱為 TruSeq synthetic long read (TSLR) technology。這項技術使用過去 BAC library 這常用來研究物種基因體的觀念,將龐大複雜的基因體切割成許多小部份,只不過每一小部份相較於 BAC,insert 增加至 Kb 以上的單位來做次世代定序。

    目前常見的兩種 Long fragment reads library 製備方式,均不需要真的 cloning放入細菌載體中複製,但會將 Kb 為單位的片段打碎後掛上各自的 barcode,再藉由後端解讀barcode,將定序的資料重新分群後以 Kb 為單位組裝,重現近似第三代定序儀讀長的結果。無庸置疑的,在定序未知物種基因體的 de novo assembly 上相當的有幫助,尤其是能跨越重覆序列 (repeat sequence) 來幫助組裝,除此之外,由於多數物種基因體為多倍型染色體,例如:人類是二倍體 (Diploid) 生物,幾百 base-pair 的讀長有時可能無法正確判斷基因座落在何條同源染色體上,如今,這項技術應用在人類染色單倍體分類 (Haplotyping) 研究,甚至能追溯親代基因型的遺傳。

 

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