目前日期文章:201608 (5)

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在大家的研究的過程中,應該很容易遇到需要將組裝的基因體上傳到NCBI資料庫上的需求。現在這些步驟,可以很輕易地使用一連串NCBI提供的網頁介面或是工具完成,這篇文章就來簡單的介紹這些工具該如何使用。

利用 NCBI Submission Portal 上傳 draft genome

2014NCBI更新Whole Genome Shotgun (WGS)資料的上傳方式之後,現在上傳draft genome (意即組裝序列中間有N,或是未完全連接起來的scaffolds)的步驟變得非常簡易以及方便。可以直接根據網站上的指示,一步步地完成上傳工作。

首先登入你的NCBI帳號,並開啟Submission Protal頁面(https://submit.ncbi.nlm.nih.gov/),如下圖,便可以看到Genome (WGS) 的上傳頁面

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在表觀基因體學中,Histones與其上攜帶的修飾是否可以被帶到下一代中一直是核心的爭論議題。不像是DNA或是其他核酸樣板的修飾,Histones修飾的遺傳性一直都還未能解決。主要原因在於Histones到底是如何的在核酸複製時產生之replication fork中同步遺傳仍然是未解之謎。

不過有越來越多的證據顯示在Histones上的標記應該是可以進行遺傳的。在2015年的兩篇Science發表的報告顯示了H3K9甲基化是可以遺傳到好幾個細胞世代。MoazedAllshire的團隊分別發現了這個現象,如下圖一,在Clr4 H3K9 methyltransferase作用下,H3K9me可以在不同世代的酵母菌(Schizosaccharomyces pombe )中產生遺傳作用,而且是在沒有cis-acting transcription factors或是相關DNA sequence情形下產生。重要的是,需要抑制住Epe1(一個推定的 demethylase)之作用。在Strome等人也發現類似的現象。他們在C. elegans上發現與Polycomb repressive complex 2(PRC2)有關的H3K27甲基化在沒有PRC2的時候也能夠表現在子代。雖然有這些證據,但是詳細的分子機轉仍然有待研究。有部分可能可由PRC2之結構有關。

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圖一  H3K9me defines a silent state that can be epigenetically inherited.

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有研究指出有40%的機率成年男性/女性會發生禿頭(這裡指的是一般常見的雄性禿androgenic alopecia),而發生的主要原因為毛囊對於具有高活性的雄性賀爾蒙(雙氫睪固酮)感受性增加有關,意即是體內的雙氫睪固酮被生成可能會導致毛囊萎縮造成落髮。血液之中會含有許多的雄性賀爾蒙(睪固酮)絕大多數(~97%)會和血漿蛋白結合而不會進入毛囊組織中,但仍有少數(~3%)游離的睪固酮會進入組織中並與 還原酶 (5 alpha reductase)作用生成雙氫睪固酮(DHT)(如圖1)。接下來,毛囊組織中的雄性激素受體androgen receptor會分別和這些睪固酮及雙氫睪固酮結合並進行後續的調控,而影響毛囊的生長(如圖2)

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1.()酮與5α還原酶作用産生雙氫睪()酮。

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在定量上,digital PCR (dPCR)real-time PCR (qPCR) 間最大的不同,是digital PCR利用chipdroplet的形式將需要定量的樣品分隔成大量的小分隔,將稀釋的樣品侷限在各分隔中來進行反應,對個別分隔偵測樣品存在與否來決定樣品分子的數量。目前dPCR已被廣泛用於基因序列變異的偵測,如copy number variants或點突變。在分子診斷上,dPCR被應用於癌症學、傳染病學、胎兒基因篩檢及移植排斥反應的預測等。

Rare sequence mutationcopy number數量的偵測為dPCR的優勢;由於dPCR是藉由單一分隔的陰性或陽性訊號來判別,因此不會受限於PCR增幅效應的影響,不需標準曲線來推測分子數目,屬於絕對定量,對於微量樣品的偵測相當有利;但微量定量實驗中,若出現primer設計不良或樣品污染的情形造成false-positive,則會對實驗結果造成極大的誤差。

Rare Variants

若利用dPCR來偵測rare variants,可能發生困難的原因有下面幾個情況:一為dPCR對結果的高度敏銳性並無法避免實驗可能出現的cross-reactivity (fig. 1);用以偵測mutant的引子有可能以較低的增幅偵測到wild type的訊號,若要讓wild typemutant間的差異顯著到能夠被區分,需要調整PCR的條件或重新設計更為適用的引子對。另一個狀況,雖然dPCR有能力從10000wild type序列中找到一個SNP,但也意味著需要50000gene copy數來保證樣品中含有至少一個目標SNP的可能性達到99%,而這樣的樣品濃度在定量上很可能過高,而且在部分案例也很難收集到如此數量的樣本。

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16S metagenomics中,操作分類單元Operational taxonomic unit (OTU)是根據序列的相似性做分類。其方法為叢集相似的16S rDNA基因序列的定序的片段。在每一個叢集中根據設定的序列相似性程度呈現一個OTU,形成的OTU可能為細菌的屬或種層級。一般而言,在16S metagenomics分析中97%99%的序列相似性為典型的OTU叢集分析的門檻。

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在進行16S序列相似性分類後,將得到的每一個OTU視為與資料庫對應相符的細菌種層級上的分類物種,並繼續進行16S metagenomics分析流程。然而實際上其解析度是有所限制,並非單一OTU為完全對應對單一菌種。影響解析度的因素如下,以16S rDNA基因相似程度97%為例:

一.  某些物種間的基因序列相似程度大於97%,因此分類出的OTU中將包含多個物種。

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