目前日期文章:201702 (3)

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作者:劉祥欽/有勁生物科技

血液中會有一些大小在150~200 bp左右,被稱為cell-free DNA (cfDNA) 的小片段游離DNA,它們是來自於細胞凋亡的過程中尚未被完全降解的殘餘DNA。當身體中有癌症組織不斷增長時,部分癌細胞也會因為免疫系統的對抗而凋亡,進而釋放出一些游離的DNA到血液中 (circulating tumor DNA, ctDNA)組織的癌化常常是因為不斷累積的基因突變所造成的不可逆反應,如果可以辨識出這些可能導致癌化的突變點位,那我們就有機會提早發現癌症與監測治療的效果。

現在,次世代定序 (next generation sequencing, NGS) 為此提供了可能的解方。從大量的cfDNA序列資料中,我們可以從中提取出含有突變點位的序列,但是因為在癌症病程的早期ctDNA所佔的比例通常很低,因此能正確檢測到含量多低的ctDNA會是檢測能否成功的關鍵所在。一般來說,要定出佔2.5%的ctDNA會需要1000倍以上的定序深度。要在特定區域達到這樣的定序深度,可使用hybridization capture或PCR放大的方式來完成。因為有只須少量DNA及實驗流程相對簡單的好處,PCR放大的方法是較被偏好的一種方式。然而在放大過程中,無可避免的會產生一些PCR造成的錯誤 (每個base因為PCR polymerase所造成的錯誤率大約10-6),此外,定序時所導入的錯誤率更高,例如Illumina MiSeq系統會有每個base約0.01到0.1的錯誤機率。低佔比加上高錯誤率大幅提高了辨識變異ctDNA的難度。

為了解決這樣的問題,每一條DNA在被放大之前就要加上一段可供辨識與複製,被稱為分子條碼 (molecular barcode)的獨特序列,如此, 因為PCR或定序而產生的錯誤就可以被辨識與排除,而計算分子條碼的數量亦可估計出偏差較少的變異ctDNA比例。目前,市面上已經有一些可以用來製備定序用DNA文庫 (library) 的產品,但導入分子條碼的產品屈指可數,其中,QIAGEN的QIAseq™ targeted DNA panel是一個可使用在Ion Torrent或Illumina這兩個主流系統的產品。它在製備library時,會先將帶有分子條碼的adapter接上任意cfDNA的5’端位置,如此每一條cfDNA皆會有自己的一組分子條碼,附帶一提,這個分子條碼由12個任意鹼基對組成,因此可標記412 (16,777,216) 條cfDNA。接好後,再用設計好針對欲定序區域特定序列的引子與針對adapter上固定序列的引子用PCR放大,最後,再用一組universal primer導入sample index及進一步放大以供定序 (https://goo.gl/771N8Z, 圖一)。

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近年來,NIPT非侵入性產前染色體檢在臨床上已被大量的應用,因不需做羊膜穿刺,且僅須懷孕十週以上即可檢測,又加上NIPT具有高度正確性99%以上,因此讓許多孕婦多了一個可以更安心的選擇。不過,國際上對於NIPT的定位仍然屬於篩選性質,而非作為診斷的唯一依據,目的在於篩選出較有可能懷有染色體套數異常胎兒的孕婦,並即早讓醫師判斷是否需要進行進一步侵入性檢查及安排後續的醫療計畫。

當NIPT結果是檢出或高度風險時,就代表胎兒一定是染色體套數異常嗎? 答案是否定的。如果以PPV1 (定義如下圖一)表示檢出或高度風險結果的正確性,依照研究2,3,4,NIPT的PPV最低40%到最高80%,代表針對被NIPT認定為positive的群組中,並非一定都是懷有染色體異常之胎兒。

圖一

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ENCODE是美國NHGRI (National Human Genome Research Institute)在2003所開始的一個計畫,目的是希望能註解人類基因體上的功能,包含去註解基因、RNA、轉錄調節相關的區域  (transcriptional regulatory regions)、染色質狀態(chromatin state)、DNA甲基化 (DNA methylation)等項目。下圖是ENCODE所想要註解的目標及其相對應的研究方法統整:

170202_1.png

ENCODE在推行上分為兩大階段:

  1. Pilot project phase (2003-2007): 此階段以建立與測試實驗和分析流程為主,主要針對200筆資料中,分散於各處且總長約30Mb的人類基因體區域 (大約人類基因體的1%)來做分析。
  2. Production phase (2007-現在): 此階段使用前一階段所建立的實驗和分析流程,將分析目標拓展到整個人類基因體。

除了人類基因體的註解之外,ENCODE所建立的實驗及分析流程也被其他計畫用來註解其他種生物的基因體,像是老鼠、果蠅、線蟲等模式生物,其相關的計畫有:

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