目前分類:Optical Mapping (8)

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臺灣大學TechComm科技共同空間主辦[次世代高通量核酸定序工作坊] ,有勁將於當日分享光學圖譜(Optical Mapping)和基因體序列組裝(Genome de novo Assembly)的分析經驗。工作坊內容包含介紹Optical Mapping 的技術,不需要Cloning、PCR及Hybridization等技術,也不需要任何核酸序列的資料,就可提供高解析度的全基因體之限制酶酵素圖譜,進而瞭解完整的基因體架構。

現場還有專案研究諮商,歡迎有興趣的老師和同學撥空參加,演講相關訊息如下:

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    DNA 的甲基化現象 (DNA methylation) 是表觀基因體機制 (epigenetic mechanism) 中的一種,其對於真核生物基因調控而言是非常重要,真核生物基因的 5’ 端,常可見到高密度的雙鹼基 C-G 存在,其被稱為 CpG islands,而其中大約有 2-7%的胞嘧啶 (Cytosine),藉著 DNA 甲基轉移酶 (DNA methyltransferase) 作用下被甲基化。另外,在原核生物中,DNA 甲基轉移酶主要的功用是用作保護自己 DNA的手段,以避免遭受內生的限制酶剪切,而利用限制酶對付外來侵略性的 DNA,而在真核生物中,也有藉由 DNA 甲基化來避免 retrovirus 表現的防禦機制被報導過,但無論如何,最主要的功能還是在於調控基因表現為主。

    研究 DNA methylation 現象的實驗方法有許多種,包括重亞硫酸鹽 (bisulfate) 和非重亞硫酸鹽 (non-bisulfite) 的方法,在樣品處理重亞硫酸鹽的部分,胞嘧啶(Cytosine) 會脫去胺基變成尿嘧啶 (Uracil),但是被甲基化的胞嘧啶不會被改變,經 PCR 放大之後定序,比對原有參考物種序列,可以知道哪些胞嘧啶發生了點突變,沒有突變的胞嘧啶,有可能就是被甲基化的候選,在非使用重亞硫酸鹽的方法中,主要是使用對甲基化敏感的限制酵素來當作工具,隨後搭配AFLP (amplified fragment length polymorphism) 技術來做研究。

    2008 年,致力於開發 Optical mapping技術的 Schwartz 團隊,發表一篇利用這項技術來研究DNA 甲基化現象的期刊,他們首先在 E. coli 上做測試,當發現這項結合可行之後,將頭腦動到真核生物中,同樣被熱門研究的人類染色體上。在真核生物上進行 Optical mapping 時,較於原核生物容易出現一個問題

,即是不一定有能製造出足夠切位的限制酶,當電腦分析切位不足的單分子 DNA 影像時,無法轉換成鑑別性高的條帶 (barcode) 資訊,因此會面臨片段重組上的難題。在他們進行人類第九號染色體DNA 甲基化現象研究時,嘗試使用 2 種以上的限制酶來克服上述的問題,一種是在非重亞硫酸鹽研究方法中提到對甲基化敏感的限制酶:EagI (C^GGCCG),另一種是辨識切位完全與前一種不會重疊、對於 CMepG 甲基化不敏感、用來製造條帶資訊的限制酶:SwaI (ATTT^AAAT)SwaI 在人類基因體序列中,按照電腦分析大致上能切碎成平均約 15 kb 的片段,而 EagI 在不考慮甲基化情形下,按照電腦分析大致上能切碎成平均約 32 kb 的片段。如同預期的,EagI 的辨識切位可涵蓋了 78%、大約 27,437 個 CpG islands,而其中大約一半的是獨一切位,將這項預測結果搭配上用來製造條帶的SwaI 實際進行Optical mapping 實驗,電腦記錄分析了實際實驗後的結果 (圖一),並組成了一些 contig 片段,再與電腦模擬片段去做平行比較。

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致病性微生物的來源管控及監測對於預防群體感染是相當重要的,傳統上須藉由比較微生物基因體結構上的相似度來找尋感染的源頭,常見的分子檢測方式為PFGE。Optical mapping能在短時間內得到微生物的全基因體限制酶切位圖譜, 因此,在比較不同來源微生物的基因體結構上,能得到比PFGE更精確且詳盡的資訊。目前Optical mapping在管控致病性微生物上,對於找尋醫院內部集體感染抗藥性金黃色葡萄球菌(Methicillin Resistant Staphylococcus aureus, MRSA)的傳播來源及細菌抗藥基因和毒性基因的分析,皆能提供即時且精確的資訊。

抗藥性金黃色葡萄球菌是醫院院內感染最常見的菌種,免疫力較差的住院患者常一旦被感染後,容易因為敗血症而導致死亡,因此,抗藥性金黃色葡萄球菌在醫院內的感染管控是相當重要的。下圖為以optical mapping找尋感染來源的實際案例,以不同病房內所採集到的抗藥性金黃色葡萄球菌之限制酶切位圖譜,與被感染的患者身上收集到的細菌之切位圖譜做相似度的比較,能準確的找出病人被感染之來源病房,並且得以針對特定病房做消毒及管控,進而達到防止集體感染之目的。

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在進行 de novo sequencing 時,假如我們只利用NGS的資料要將全基因體序列組裝起來,通常要非常高的覆蓋率 (coverage) 才可能將基因體組裝起來,但是,如此高的覆蓋率,不但定序費用相當高,而且面對龐大的資料量,組裝所需的硬體需求將是我們所面臨的第一個難題,組裝所需的漫長運算時間,則是另一個難題,此外,組裝錯誤亦無法被查覺。

利用 Optical mapping 可以更有效率地進行 de novo sequencing ,以更低的成本,更快的速度組完全基因體序列。

首先,我們利用 Optical mapping 建立全基因體的圖譜。


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一般在做全基因體比較時,通常會先得到全基體的序列,然後再比較基因體之間的差異。

但是,當我們還不知道這些基因體是否存在差異前,貿然進行全基因體定序,倘若結果未能如我們預期,定序所花費大量的人力、物力與金錢無異是種浪費。

在定序前,我們可以先以 Optical mapping 來分析我們要比較的基因體:

  • 如果基因體間沒有差異,我們就可以節省時間與金錢,不必再做進一步的定序。
  • 如果基因體間存在差異,再進行定序的工作,如此不但工作較有效果,而且Optical mapping 的結果亦可輔助全基因定序的工作,提升全基因體定序的效率。


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菌株分型(strain typing)是分析菌株差異性常用的方法。

過去常用的方法是 PFGE (Pulsed Field Gel Electrophoresis),但是PFGE的缺點是

  1. 只提供少量的資訊
  2. 對於相近菌種的區別性不佳

使用 optical mapping 的話,即便是相近的菌株,我們仍能有效地加以區分,另外,除了分型之外,我們還能利用全基因體的比較而得知不同菌株間 insertion、deletion與基因轉置等等現象。

下圖即為 optical mapping 分析 strain typing 的結果,圖中兩菌株間的線條所標示之處即為菌株間相異之處。

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Optical mapping 是利用限制酶去裁切單分子DNA,產生單分子DNA圖譜,然後將許多單分子DNA圖譜組裝起來,以得到全基因體圖譜的一種技術。

其實驗步驟如下:

一、以PDMS組成的微流道,利用毛細現象的原理,將DNA拉直,由於微流道下方的玻片為帶有正電之玻片,利用DNA帶負電的特性,將DNA固定在特殊玻片上(正負電相吸),此時,我們會得到一條筆直的單分子DNA。

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