目前分類:mRNA sequencing (8)

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上圖來源於(http://sourceforge.net/projects/trinityrnaseq/files/misc/RNASEQ_WORKSHOP/rnaseq_workshop_slides.pdf/download)

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RNA-Seq 雖然是這幾年發展的技術,但已經成為分析 transcriptome 的方法,可用來組裝 transcript ,發現 splicing variants 、 single-nucleotide variations 及 fusion genes 等,而 strand specific RNA 更可協助 transcript 組裝及 genome annotation 的正確性。 Lin Wang 等人在 2011 年發表在 PLoS ONE 期刊所發表的研究,提到如何做 strand specific RNA 的 Library construction、與 non-strand specific RNA protocol 比較,及協助證實 gene model 正確性,以下就做個介紹:

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在次世代定序 RNA-seq 成為 transcriptome 研究的主要來源前,我們多是使用 microarray 來分析基因體表現量的變化與樣本條件之間的關聯性,例如:基因表現量與不同組織細胞的性狀。每一個個體的 transcriptome 受到基因體變異而不一樣,像是 SNP、copy number 的變異。而直接分析轉錄本的表現量變化是最容易觀察到與性狀之間的關係。一般定義真核細胞中的一個基因被轉錄後,其調控會透過 RNA edit (例如 splicing ) 形成多種轉錄本。不同轉錄本的表現量變化造成性狀不同的關聯性可能更高。RNA-seq 高解析度的定量 mRNA,提供給研究人員們一個機會來研究轉錄本的變化。

於是有西班牙生物資訊學家開始研究如何用 RNA-seq 來分析 reference genome 上的同一個基因內不同轉錄本表現量的差異。轉錄體的比較比基因表現量的比較要來的複雜。計算上,我們會假設不同的基因之間表現量的資訊是獨立變數,但是相同基因內的轉錄本數量,卻有相依性。某一轉錄本的數量越多會造成其他轉錄本的表現量減少。因此需要思考各個轉錄本 RPKM 在個體間的差異要如何分析。

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研究生物基因轉錄體的方法有許多種,而使用次代定序儀系統進行轉錄體定序是目前相當熱門的一種方式,科學家們使用 RNA-seq 分析轉錄體表現主要期望能夠獲得三種重要資訊:1. 了解整個轉錄體構造、splicing 位置以及註解基因的功能。2. 將所有轉錄體的表現量多寡定量。3. 找出 alternative splicing 的可能性方式。

   相較於使用轉錄體反應 DNA-RNA 雜合為基礎的 RNA microarray,可以直接地得知轉錄體的方向性,但目前 RNA-seq 所常用的製備方法必須反轉錄成 cDNA,因此缺少了轉錄體序列的方向性,而分析上針對這個問題所作的解決方式為,例如:利用轉譯的蛋白質基因預測 open reading frame、利用 3’端定序量常較 5’端多的 bias、以及藉由真核生物 splicing 位置方向來做判斷。但即使如此,發展能區分出方向性的 RNA-seq 製備方式是很重要的,這是因為當面對較小基因體的物種,如微生物或低等真核生物時,基因會密集的出現在 DNA 的正負股上,而無法確認方向性會造成評估基因表現量上的誤判,另外,當轉錄體表現時,也有機會產生負股調控基因的轉錄體,這些轉錄體並不轉譯,但與蛋白質表現量卻息息相關。

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目前發展成熟而被應用在許多研究的次世代定序技術中,被定序的library 大多為DNA而非RNA(定序原理請參照本部落格先前文章),在現有的mRNA-seq技術中,需先將RNA反轉錄為DNA,製備出DNA型態的library後,始能執行定序反應。針對mRNA-seq,近日Lira Mamanova團隊以Illumina定序平台為基礎,發展出可直接以RNA library做為定序材料的新技術,名為FRT-seq(Flowcell Reverse Transcription sequencing),此技術將RNA library注入flowcell內,並且直接在flowcell內執行反轉錄及bridge PCRFRT-seq能完整保留RNA正負股的資訊(strand-specific mRNA sequencing),除此之外,其製備library過程中不需經由PCR的放大,所以可以減少PCR所產生的錯誤(請參照本部落格PCR free文章)

FRT-seq library的製備過程中,首先將mRNA純化出來並且打斷,再將RNA3'5'端分別接上兩段特殊設計且不同序列的adapter,經由qPCRlibrary分子大小的檢查後,便能以Illumina cBotRNA library注入flowcell內,經由反轉錄及bridge PCR反應後,即可執行定序反應,流程如下圖所示。

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在原核生物中,mRNA 只佔全部 RNA 的 1-5%,其餘絕大部分是 ribosomal RNA,因此若要定序 mRNA 首先必須先將 mRNA 純化出來,然而,原核生物並不像真核生物 mRNA 具有 poly A 的結構,因此,無法直接利用 oligo T 將 mRNA 純化出來,如果拿 total RNA 進行定序,那麼定序的效率一定會非常差,因為大部分的序列都來自 rRNA;如何提升原核生物 mRNA 的量,已成為 NGS 系統的重要議題,目前,提升原核生物 mRNA 的量,最主要的方式不外乎分為兩大類,第一類是減少 rRNA 的量(下圖 a 與 b ),圖 a 的方式是利用 rRNA 的 probe 將 rRNA 去除,這也是最常用的方式,然而,去除 rRNA 的效率會與 probe 序列的設計與生物物種有關;圖 b 的方式是利用針對 rRNA 作用的酵素將 rRNA 去除,主要是利用原核生物的 mRNA 5’端有三個磷酸,而此酵素無法對三個磷酸的結構作用,因此,能夠有效去除 rRNA。

新圖片 (5).png 

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由於原核生物的 mRNA缺乏poly-A的結構,使得要純化出原核生物的mRNA技術困難度要比真核生物高出許多,目前比較常用的方式是利用hybridization去除rRNA後,再進行RNA的定序,然而,不同的物種去除的效果差異頗大,定序結果中,往往只有大約10-20%的mRNA,其餘大部分為rRNA的序列,圖一為Shaomei He團隊的研究結果,a與b分別來自兩個的環境樣品metatranscriptome的結果,結果可以發現hybridization去除rRNA效果不盡理想,尤其是樣品b,即使利用兩次hybridization,非rRNA的比例也只有11.3%,如何有效降低rRNA比例將是研究員何生物轉錄體的重要課題。

圖一:

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相較於傳統的microarray方法,RNA sequencing究竟有著什麼樣的優點,讓我們必須讓我們從microarray轉換到RNA sequencing呢?


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