隨著 NGS 技術演進,這項越來越成熟的技術慢慢促進許多領域的發展及快速成長,包括人類發展學、基因表現及調控、基因變異學及年齡與衰老相關研究等,未來更有可能影響醫藥、健康看護、疾病預防及臨床醫藥治療等領域發展。
樣品製備成 library 提供 NGS 上機在這項技術占有很重要的地位,目前在操作 whole genomic DNA library 時,首先需要面對的問題是如何將 genomic DNA 片段化至適當的大小,並且必須盡可能使斷點隨機及減小 DNA 受損程度。目前常見的方式是使用物理性的超音波震碎,例如:Covaris、Biorupter,或是使用液態壓力將分子截斷,例如:Hydroshear,除此之外,尚有使用特殊酵素 (fragmentase) 切斷 DNA 的方式及 transposon 插斷 DNA 的方式。
微波爐加熱應用在實驗室工作上並不少見,它被使用在促進細胞裂解、加速化學反應,微波爐的放射線被應用在增加酵素裂解蛋白質反應速度,然而應用在處理核酸裂解方面目前則從未被實驗過,若能控制得並再現性高,想必可以同時擁有減少實驗時間及同時處理大量樣品兩項優點。
微波爐的DNA 的片段化實驗以以下方式來進行,調整不同溫度及時間測試 genomic DNA 的變化,而常見的 Covaris 超音波震碎法以及較少見的高溫處理法被用來當作此項實驗的對照組,處理後以洋菜膠體電泳方式確認 DNA 分子大小分布。隨後,依照 Roche 454 library 製備標準流程建構 library,在 ligation 後的產物,使用 Bio-Rad real-time PCR 試劑分析並且同時放大總量,純化後再以 Agilent 2100 bioanalyzer 自動電泳觀察 library 分子量大小,最後以 Roche 454 pyrosequencing 系統上機定序及後續軟體分析數據。
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急性骨髓性白血症 Acute myeloid leukemia (AML) 通常是由於體細胞的基因突變所造成,尤其是早期進行造血作用 (hematopoiesis) 的stem cell 和 myeloid progenitor cell。而 FLT3 這個 receptor的異常在 AML 的形成中扮演著重要腳色,尤其是含有FLT3 ITD (Fms-like Tyrosine Kinase-3 Internal Tandem Duplication)的病例在AML 中所佔的比例約有 20-30% 的高比例,其餘則是 point mutation 所造成的基因異常,例如在 D835。
FLT3 基因在早期的造血細胞才會有比較高的表現量,它的位置在 13q12.2,含有 24 個exon, ORF是2979 bps。而 FLT3 ITD是在其 juxtamembane domain 的位置有片段大小不一的 insertion (約在 exon 14到15 之間) ,長度大約在 15-300不等。FLT3 ITD 會使的FLT3 在沒有 ligand 的情況下持續被活化,讓下游的PI3K 和 RAS pathway 處於一個異常的狀態。FLT3的持續活化會造成細胞增生 (cell proliferation) 以及抑制細胞凋亡 (apoptosis),這也是血癌形成的主因。
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隨著NGS次代定序的技術不斷的推陳出新,其能力所涵蓋的層面亦越來越豐富,但一套完整的NGS,其構成的條件,不單只有最新的定序儀器就足夠,定序核酸樣品的良劣往往左右最後定序結果,所謂工欲善其事,必先利其器,要怎麼收穫就要先怎麼栽的道理。本篇文章主要淺談游離核酸(Cell-Free nucleic acids) 的品質對於NGS定序之重要性。在醫學方面,以游離核酸的研究漸趨深入,其為一種細胞外呈游離狀態的小片段核酸,存在於血液、尿液與唾液等…,大部分可經由三種方式:細胞凋亡(apoptosis)、細胞壞死(necrosis)與胞泌作用(secretion)進行胞外釋放(圖一),其中又以游離DNA (Cell-Free DNA,cfDNA) 應用於癌症腫瘤監控及胎兒產前的診斷(圖二)之進展最為豐富。
圖一
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自從 NGS 技術發展至今,已有無數的古老生物被進行定序,這些生物樣品可能來自數千年以前。為了進行定序,首先需要將這些受損或降解的 DNA 片段製備成可供 NGS 定序儀上機使用的 library,而製備的目的主要是讓 DNA 片段兩端接上人工合成的 adapter,一則可起始定序反應,一則可用作 PCR 增輻反應。目前製備的主流方式分為兩種:一種是 454 Life science 使用的 blund end ligation;另一種是 Illumina 使用 Y 型結構的 adapter 進行 A-T ligating,不論何種方式,均為雙股 DNA 的黏合反應,然而,在操作古老 DNA 時,這種製備流程可能會發生一些缺憾。
使用新的單股 DNA 來製備 NGS library,比較目前常見的方式具有以下的優點:
第一、製備過程中 DNA 標示上 biotin,因此純化的步驟使用 streptavidin-coated的磁珠,能減少樣品流失。
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人類乳突病毒Human Papilloma virus(HPV)是一種分子較小直徑約55nm的DNA病毒,目前人類乳突病毒有一百多種基因型,不同基因型的人類乳突病毒引起的疾病種類不盡相同,其中以30~40種類型的人類乳突病毒會透過性行為傳染到生殖器或周邊皮膚,而這些種類當中又以10~15種最容易引起子宮頸癌與其他生殖道癌,例如HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59和68
被稱為高危險性病毒。人類乳突病毒除了導致大家所熟悉的子宮頸癌之外,在流行病學與分子生物學研究報告中顯示人類乳突病毒也可能造成頭頸癌的發生。
加拿大知名生物學家在Human Papilloma virus研究中
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在哺乳動物,DNA 甲基化通常發生在CpG dinucleotides 上,而且是研究基因調控和疾病誘發重要的epigenetic mark 。詳細的了解 DNA 甲基化程度和位置對於研究發育 (development) 和疾病型態 (disease phenotype) 有很大的幫助,尤其以癌症來說,甲基化的研究可以提供診斷的 biomarker。在哺乳動物的DNA大約有~1 % 的 5’-methylcytosine (5MeC), 其中這甲基化有70~80% 位於CpG dinucleotides。但是DNA methylation pattern 在每一個個體或是組織會有所不同,是處於一種動態的模式,這樣的情況讓基因的定序常常有偏差的情況發生。
近年發展了三種研究 DNA 甲基化的主要方法:
1. Chemical conversion with sodium bisulfite
2. Digestion with methylation-sensitive restriction enzymes
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真核生物的genome size較原核生物大,且有許多條大小不一的染色體,所以在進行optical mapping及定序資料的組裝上較為困難。若能將真核生物的每個染色體獨立的分離出來,再分別進行定序或解出restriction enzyme map,對序列組裝上會有相當大的幫助。
將不同大小型態的染色體分離出來的技術一直以來都有許多研究團隊在開發,其中的技術包含使用micromanipulator配合雷射切割、使用原子力顯微鏡atomic force microscope nanolithography及流式細胞儀Flow cytometry,其中流式細胞儀Flow cytometry是被認為分離效果較佳的技術。
Flow cytometry是生物學上相當常用的技術之一,例如當一個樣品中混有許多不同特性的細胞在裡面時,Flow cytometry可以依據細胞的顆粒性及螢光染色呈色性,將相同性質的細胞做分群分析且可將同一性質的細胞分別分離出來。不同染色體之間的大小及DNA螢光染劑染色後的螢光相對強度亦不相同,所以可以利用Flow cytometry將染色體獨立的分開來(如下圖)。
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DNA Genotek® OrageneˑDNA ( OG-500 )DNA Collection Kit在臨床上的應用
在實驗室大家應該都有使用過DNA萃取套組 ( DNA isolation ) 的經驗,大部分的DNA萃取套組都需要一定的樣品量或檢體才可以萃取到足夠量的DNA,並且會因樣品取得的難易度及樣品保存的效果而影響後續實驗的結果好壞,倘若萃取出來的DNA品質還要符合生物晶片 ( Microarray ) 或次世代定序 ( Next generation sequencing , NGS )等實驗的樣品要求則難度相對提高許多。
目前 DNA Genotek® 公司推出一款 OrageneˑDNA (OG-500) 樣品保存套組 (DNA Collection Kit ),可藉由此套組將臨床上病人少量的唾液樣品快速保存起來,經測試此套組所保存的樣品在 24°C 及 37°C 測試條件保存五年,發現所萃取的 DNA 片段長度仍可維持在 23Kb 以上,而在 50°C 保存條件下樣品 DNA 至少可以維持 187 天 ( 如表1 )。
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科學家們發現在不同環境發現的古生物化石 DNA,其受損降解的情形其實是很類似的,使用次代定序的平臺研究古代 DNA 能夠直接的檢測許多現象,為人熟知的例如:嘌呤丟失作用 (Depurination)、胞嘧啶的去胺基作用(Cytosine deamiation)、fragmentation rate……等等。
下圖一是研究人員將始祖馬的次代定序所獲得的讀序,比對回現代馬基因體後所做的統計分析結果,觀察發現古生物 DNA 時常斷裂在嘌呤 (Guanine、Adenosine) 的後方 (Y 軸標示 -1 位置),也因此讀序的第一個鹼基 (Y 軸標示 +1 位置) 有較高的機率出現嘧啶 (Cytosine、Thymine ),這一項證據似乎可以證明嘌呤丟失作用 (Depurination) 對於 DNA 斷裂降解的影響。
圖一
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之前我們在”跨越定序平台的迷思”一文中提到,同一個library在Illumina的兩個不同定序機台 (Miseq 及 Hiseq2000) 定序的結果並沒有特別的差異。然而,同一樣品在不同 library 製備方法下,會產生出不同的定序結果嗎?
2012 年 Joern Toedling 的研究團隊以 small RNA sequencing 做了一系列相關的研究,其將老鼠的 ES_XX (embryonic stem cell line female) 及 ES_XY (embryonic stem cell line male) 做為比較的對象,以不同平台的 small RNA library 的製備法處理樣品,並且分析其定序資料,不同製備法配合樣品的資訊如下表。
作者以 pair-wise Spearman rank correlation 分析上表十個樣品間 miRNA reads 數量的 correlation,並且將結果以 heatmap 形式呈現(如下圖)
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即時聚合酶鏈鎖反應(Real-time polymerase chain reaction,簡稱為Real-time PCR),又稱定量即時聚合酶鏈鎖反應(Quantitative real time polymerase chain reaction,簡稱為Q-PCR)。Q-PCR是藉由PCR擴增原理將DNA放大的同時並達到即時定量之結果,若使用傳統PCR方法來定量的話是較費時費工又容易汙染,因此Q-PCR已經廣泛使用在定量這方面。
目前Q-PCR常用化學物質大致上可以分為:非專一性化學物質(SYBR Green )與專一性化學物質(TaqMan probe)。分述如下:
1.SYBR Green I
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不管是測DNA、RNA或是protein濃度單位大多以ng/μl為準,很少會以nM為單位。因此對於這方面的單位換算來說許多人都很陌生,也因為陌生可能導致遺忘如何換算或因陌生而不敢接觸,所以在這我們將舉個簡單的例子來說明ng/μl與nM的單位換算方式。
例子1.
假如DNA濃度是10ng/μl
DNA size是300bp (DNA每個bp 分子量為650)
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Library construction過程中,DNA及RNA濃度的精準測定是相當重要的。尤其在製備library之前,必須要了解樣品的濃度,才能取出適當總量的DNA或RNA做為製備的原料,若因為濃度偵測的不準確,會導致最後library產物總量不足夠上機定序。目前常見的DNA及RNA濃度測定方法有吸光值測定法、專一性螢光染劑測定法。
一. 吸光值測定法
Beer-Lambert law顯示,分子對於特定波長光之吸光程度會隨著分子濃度而有所不同,所以可以藉由測量溶液的吸光程度optical density推估分子的濃度1。DNA及RNA分子會吸收波長260nm的光,所以可藉由260nm的吸光值換算成濃度(如下圖所示)。此測定法操作簡單且快速,但極容易造成量測的不準確,因為若萃取DNA或RNA的過程中,溶液混有其他也會吸收260nm波長光的物質,常常會造成高估DNA及RNA的濃度,進而影響後續實驗的進行。
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PCR-Free 顧名思義是指不經 PCR 步驟而完成 library construction。
一般來說 library construction 都須經由 PCR 放大再做定序,放大後的 library 會產生幾種情況:
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