自2005年Roche推出Roche/454 Genome Sequencer 20 System後,開啟了次世代定序的大門,經過不到10年的時間,第三世代的定序技術平台也問世了。本篇文章主要是介紹2010由Pacific Biosciences 公司發表的定序平台---PacBio RS,以及其定序原理---Single Molecule Real Time (SMRT) technology。

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Figure 1. Zero-mode wave-guides (ZMWs) – small well-like containers & SMRT Cell & PacBio RS (擷取自http://smrt.me d.cornell.edu/FAQs.html)

 

在介紹Single Molecule Real Time (SMRT)之前,必須先簡單介紹zero-mode waveguide(ZMW) technology,此技術乃Single Molecule Real Time (SMRT) technology的靈魂。2003年由Watt Webb和Harold Craighead在Science共同發表的文章揭露了zero-mode waveguide(ZMW) technology,是後來 PacBio不可或缺的重要技術。

ZMW 是非常微小的孔洞,其直徑只有70 nm,深度有100 nm 。而單一一個DNA polymerase 就座落在ZMW well之中。許多個ZMW well 就可以組成一個SMRT Cell---一個光波導式感測晶片。

Zero-mode waveguide (ZMW) 的特別之處在於由於一個孔洞只能存在一個DNA polymerase,所以當 DNA polymerase 在行聚合反應的時候,具有不同螢光的分子的新型d NTP就會釋出會釋放有標定螢光的磷酸根。一般的定序試劑都是將螢光標定在鹼基上,但是根據Pacific Biosciences的研究人員Korlach與Turner觀察到這樣大分子的染料若是位於在鹼基上,會影響DNA polymerase的合成效率並提前終止聚合反應,並不利於SMRT的結果。另一個特別之處是ZMW這樣微小孔洞的設計可以大幅減低背景螢光訊號的干擾,因為微小的孔洞可以阻止背景的激光穿透ZMW而避免被偵測到,這樣的設計讓偵測螢光的準確度提高很多。

因DNA polymerase的聚合反應被釋放出來的標定螢光的磷酸根,其激發光源能穿透ZMW孔洞底部約20-30 nm,所以可以很快地被及時偵測,並讀取到序列。而且因為是及時的偵測到聚合反應所釋放的磷酸根,所以可以與DNA polymerase 同步,所以一秒就可以讀到1-3個base,非常快速。這樣的定序方式一次只有讀取一個DNA polymerase的反應 --因此將此技術命名為Single Molecule Real Time (SMRT) technology。

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Figure 2. SMRT ball Template 製備。Single molecule real time (SMRT) Sequencing 之前的DNA 前置的準備工作。(擷取自 PacBio and sequencing guide.)

 

Figure 2 展示的是簡單的SMRTball template 製備的流程圖,相較於一般的NGS library 製備,少了最後的 PCR 的步驟。在adapter ligation 後,在5’ 和3’端的部分接上了環狀結構的hairpin adapter,這樣的環狀結構可以讓primer 和DNA polymerase 黏合在hairpin上,然後隨著聚合反應的進行,Template的雙股打開之後變成具有forward以及reverse strand 的環狀結構。DNA polymerase 就持續重複合成這樣的環狀結構,所以也稱為Circular consensus sequencing (ccs) (Figure 3)。當然,隨著定序的時間拉長或是template的長度越短,所得到的定序量越高,coverage也就越高,精確性就高。

這樣Circular consensus sequencing (ccs) 的特點是可以將定序長度(Read length)拉得很長,以一般NGS的定序長度為例,最長也定多700 bps,但是 Single Molecule Real Time (SMRT) technology 讓定序長度硬生生地拓展到平均5000 bps,最長可能可以到10 Kb。大片段的reads非常有助於組裝基因體龐大的生物,例如: 植物和真菌。

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Figure 3. Illustration of PacBio sequence generation. Adaptors (SMRTbells) are first ligated to each amplicon, and after a sequencing primer is annealed to the SMRTbell template, DNA polymerase is bound to the complex. This polymerase-amplicon-adaptor complex is then loaded into zero-mode waveguides (ZMWs) where replication occurs, producing nucleotide-specific fluorescence. Circular consensus sequencing (ccs) allows the polymerase to repeatedly replicate the circularized strand, producing one long read with randomly distributed errors [9]. Post-run, the SMRTbell sequences are bioinformatically trimmed away, single-molecule fragments are aligned, and a consensus sequence is generated. The single-molecule coverage and accuracy of resulting ccs reads are amplicon- and read-length dependent, with smaller amplicons and longer reads giving higher single-molecule coverage and thus higher ccs read accuracy. ( 資料來源:Fichot and Norman Microbiome 2013 1:10 )

 

但是SMRT並非不是沒有缺點,其中一個缺點是這樣的定序過程會產生random substitution error散布在reads各處,高達總資料量的15%左右,所以必須要加深定序的coverage (即增加Circular consensus sequencing (ccs)的重複性),然後藉由資訊的整合消除這些 substitution error ,經過這樣的整合,定序的精確度可以達到99.9%,Pacific Biosciences 也特別標榜此定序平台針對SNP的偵測比其他定序平台有更傑出敏銳的結果。

順帶一提,Pacific Biosciences推出的這個定序平台藉由 ZMW接收到脈衝到達的時間落差以及結合了酵素動力學,進而發展出可以偵測到specific methyl residues的技術—例如原核生物的m6A、 m5C 和m4C,這對想要研究DNA methylation的人是一大福音,這部分下次再詳細介紹。而ZMW技術所可以發展出來的不僅僅是只有定序技術而已,Pacific Biosciences 未來有可能利用此項技術發展有關於ribosomal translocation 以及 protein receptor 在細胞表面的結構研究等等, 應用非常廣泛。

 

備註:

若想要更了解PacBio RS 定序平台,以下是有關於PacBio RS的影片,其中前兩篇有清楚的原理介紹以及第三篇有與SGS的比較 (全英文) :

  1.  http://www.youtube.com/watch?v=NHCJ8PtYCFc
  2.  http://vimeo.com/41415784
  3.  http://aa314.gondor.co/webinar/pacbio-smrt-sequencing-technology-applications-roadmap

 

 

參考文獻: 

  1.  Elaine R. M. 2013. Next-Generation Sequencing Platforms. Annu. Rev. Anal.6:287-303
  2.  Alice MC. 2010. Third Generation DNA Sequencing: Pacific Biosciences’ Single Molecule Real Time Technology. Chembiol. 17: 675-676
  3.  Eric B.F. and R Sean Norman. 2013. Microbial phylogenetic profiling with the Pacific Bioscience sequencing platform. Microbiome 1:10

 

 

 

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  • 遊客
  • 謝謝大大! 真夠詳細~