實驗上,我們時常使用 Polymerase Chain Reaction (PCR) 這項技術增幅目標核酸片段,這在建構NGS gDNA 或cDNA library時亦是其中重要的一環,然而實際上,進行 PCR 會因為兩種現象而機率性地產生非預期的結果:第一、在增幅過程中,片段小的 template 會傾向較容易地被放大;第二、經 PCR產生的產物有部分序列相似時,它們會在 annealing 的步驟中發生部份的雜合配對,而在extension 的步驟被 polymerase 延長,進而產生 chimeric副產物。此外,PCR 的過程中有時會伴隨 primer extension 不完整的產物產生,這樣的產物會在前述的部分配對中,在下一個 PCR cycle 繼續的被延長,但產生大小不一的 chimeric副產物。眾多的 PCR protocol 考量到上述現象,會適當地調整步驟,例如:提高 DNA模板的濃度或是降低 PCR 的 cycle 數,然而,當面對模板 DNA 極微量的情況時,就很難避免 PCR cycle 數的增加,而提高 chimera 出現的風險 (圖一、左)。

針對上述傳統 PCR 的弱點,新式的 PCR 方式被開發出現,利用油水不互溶的特性,製作出許多微小的水滴散布在油類溶液環境中,各種序列不同的模板 DNA 分子被隔離分開至各水滴中,每個水滴均為水性緩衝溶液並包含 PCR 過程所需的材料:DNA polymerase、primer、dNTPs,在適當的比例調配下,每個微小的水滴可少至僅含一條模板DNA 分子,使得每個水滴中的 PCR 反應互相不影響,只會忠實的放大同一條模板分子,所有的 PCR 產物平均地生合成且不會再因部分配對的雜合而被錯誤放大,PCR 反應材料不需競爭、也不因酵素催化的喜好性而出現偏向,徹底解決前述傳統 PCR 的問題 (圖一、右)。

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為了進一步證實 emulsion PCR 優點,將 2 組同樣需要進行 PCR反應的 random DNA library,分別使用傳統 PCR 及 emulsion PCR 增幅,測試不同反應 cycle 數下 PCR 產物的變化,並以毛細管電泳及 SDS-PAGE 進行分析及比較,下圖二呈現使用上述兩種 PCR 方式後獲得不一樣的結果。在圖二、A之 SDS-PAGE 圖中可發現,傳統 PCR 在大約 14 cycles 開始出現非專一性副產物,並且隨著 cycle 數的增加時,副產物越來越多,專一性產物卻變得越來越少,在圖二、C 之 SDS-PAGE 圖中可發現,emulsion PCR 的專一性的產物在到達高峰後即使增加 cycle 數亦維持定量,並且幾乎不產生副產物。同樣的結果可同樣在毛細管電泳圖中發現,圖二、B 傳統 PCR 的專一性的產物 peak 隨 cycle 數增加越來越少,副產物卻越來越多,而圖二、D emulsion PCR的專一性的產物 peak 在 30 cycles 後維持固定量並且觀察不到副產物的產生。將 B、D 的結果數據化後以折線圖呈現,在 圖二、E 可明顯看到傳統 PCR 的專一性產物(藍線)與非專一性副產物(黑線)隨 cycles 數增加出現消長變化。

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了解了 emulsion PCR 的好處後,接著嘗試不同濃度的 template對於反應是否會造成影響,圖三、A 嘗試使用 0.002、0.01、0.02、0.2、2 pmol/mL 的 template 進行 emulsion PCR,結果發現當 template 的濃度太濃時,即使使用 emulsion PCR 仍然會產生大量的副產物,回頭確認實驗條件,在光學顯微鏡底下可觀察到水滴在油溶液生成的直徑大約是 4 μm,而 100 μL 的 PCR 緩衝溶液大約可生成 3×109個單元,與前述 template 分子濃度相比的比例大約為 1:25、1:5、2:5、4:1、40:1(template: 水滴),由此可推斷,當越多的 template 被包裹進水滴當中進行反應時,副產物就越容易生成,在這個實驗當中最適合的 template 濃度,應該是 0.01 pmol/mL,也就是與水滴的比例在 1:5(template: 水滴)時,是最好的。

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除了 template 濃度之外,我們知道 PCR 的要素還包含了 annealing 溫度、primer、Taq DNA polymerase,在一般的觀念當中,我們知道提高 annealing 溫度可以增加 primer 專一性,並且能夠盡量避免副產物產生,不過在 emulsion PCR 的測試結果中,50-70℃ 的變因下副產物的產生並沒有顯著的差異性。而另外在分別測試不同濃度下的 primer、Taq DNA polymerase 當作變因時,如果按照傳統 PCR 濃度配置,primer 變化濃度對產物生成的影響不大,過量也不容易生成副產物,但相較於傳統 PCR,Taq DNA polymerase 在進行 emulsion PCR時需要使用更多(<0.1 U/μL VS. 0.125 U/μL),若是濃度過低則會影響產物最終總量,而濃度過量對於結果並不影響。
最後用實驗驗證傳統 PCR 副產物生成的原因,當只有 template 時,進行 1 cycle、30 cycles 之後,template 會馬上變成 product-product 的副產物(圖四、lane 1,6),當 PCR 反應溶液不加 primer 時,進行 1 cycle、30 cycles 之後,一樣會將 template 變成 product-product 的副產物(圖四、lane 2,7),當 PCR 反應溶液不加 dNTPs 或是 DNA polymerase 時,進行 1 cycle、30 cycles 之後,會較容易出現 primer-product的副產物(圖四、lane 3,8 及 lane 4,9),當全部 PCR 要素充足時,在第 1 cycle 可看見 primer-product 的副產物先出現(圖四、lane 5),而後隨著 PCR 反應繼續進行,primer 被使用後剩下越來越少,在 30 cycles 後出現 product-product 的副產物變得越來越多(圖四、lane 10) 20140317_pic4

Emulsion PCR 的出現,不僅能解決大多數傳統 PCR 的缺點,另外也被應用在 DNA 檢測,如:digital PCR,或是次世代的定序系統中,如:Roche 454、Ion torren,當然,在實驗的方便性及成本的考量之下,傳統的 PCR 仍有其應用的實際性,控制好 PCR 的實驗條件及要素,仍可以避免非專一性產物的大量生成,不過若是面對傳統 PCR 無法克服的弱點或極限時,也許就需要考慮嘗試不同方式來進行實驗,屆時,嘗試使用 Emulsion PCR 可能就是一項不錯的選擇。

 

 

Reference:
Shao K, Ding W, Wang F, Li H, Ma D, et al. (2011) Emulsion PCR: A High Efficient Way of PCR Amplification of Random DNA Libraries in Aptamer Selection. PLoS ONE 6(9): e24910. doi:10.1371/journal.pone.0024910
Williams R, Peisajovich SG, Miller OJ, Magdassi S, Tawfik DS, et al. (2006) Amplification of complex gene libraries by emulsion PCR. Nat Methods 3:545–550

 

 

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