定序技術不斷推陳出新,自諾貝爾化學獎得主Frederick Sanger起,迄今核酸定序之成本、時間與技術,也逐年的縮短與降低。本篇主要介紹半導體對於定序的應用,其中喬納森羅斯伯格(Jonathan M. Rothberg)扮演著舉足輕重的角色,他是位專精於生物領域的發明兼企業家(圖一),同時也是454生命科學公司(454 Life Sciences)的創業者,成功研發焦磷酸測序技術(pyrosequencing),就在羅氏公司(Roche)併購了454生命科學公司的同年,他創立Ion Torrent公司,羅斯伯格本身亦是蘋果公司創辦人賈柏斯 (Steve Jobs) 的推崇者,因而IT Information technology角度捕捉靈感,進一步將半導體微晶片的概念,跨領域的導入定序技術中,不僅在基因定序領域中具有開創新穎性,其所創造的生技經濟效益,更被富比士財富雜誌評選為封面人物(圖二)

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(圖一)

 

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(圖二)

 

     關於如何利用半導體定序,本篇將引用以羅斯伯格的研究團隊,於 2011 年發表在知名科學期刊Nature 中的文章,與讀者進行分享與介紹。不同於一般的定序平台,Ion Torrent 公司所研發的系列平台,其核心是以半導體為主,因此,儀器中沒有造價昂貴的光學判讀系統,故大幅降低設備價格,取而代之,是由電子偵測讀取器、電腦微處理器和流體系統所構成。其原理主要是在為數百萬個的反應槽(well)中 (圖三),當核苷酸(dNTP)互補結合單股DNA 時,會釋放出氫離子(H +),改變pH 值(Δ pH),透過離子感應膜,進而發生電位變化(ΔV,產生電流訊號,這樣的反應藉由半導體晶片裡的感測元件,從中判讀並區分四種 A、TCG 不同的鹼基(圖四)

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(圖三)

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(圖四)

 

    定序的核心元件即為定序晶片(Chip),係由8 吋晶圓(8′′ wafer)所製成(圖五A),其屬於互補式金屬氧化物半導體(Complementary Metal Oxide SemiconductorCMOS),晶片的中心結構,由約數百萬個陣列感測器(Sensor array)所組成(圖五B),此類型的半導體主要由離子選擇場效電晶體(Ion-Selective Field-Effect TransistorISFET) 所製成,此種感測器可於溶液中發生反應,直接將化學訊號轉換成數位信號;晶片的外圍構造(圖五B包含:一、行列選擇性暫存器(Row / Column select registers,主要用以暫存行列位址的訊息,採用二維陣列方式進行訊號讀取與傳輸;二、感測器接面與電路讀取元件(Sensor interface and readout circuitry),主要用以校正電路偏置(Bias circuits),並且利用取樣保持電路(Sample-and-hold)的概念,讓定序不斷產生變化的電壓或電流信號,進行取樣及保持穩定運作,再藉由通訊多工器(mux),將多種輸出信號連結整合到一個高速通道進行傳輸,最終藉由輸出驅動器(Output driver)把相關訊號數據進行傳出。

20140403_5.jpg  (圖五)

 

    關於定序對象的選擇與相關實驗結果(如:GC比例、晶片使用數量、定序深度與覆蓋程度等…),如下表所整理(表一),除基因組較小的費氏弧菌(Vibrio fisheri大腸桿菌(E. coli)與沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonas palustris)之外,該研究團隊特別請到英特爾公司(Intel)創辦人之一,同時也是 IC(積體電路)領域中,提出摩爾定律(Moore’s Law)之發表者高登‧摩爾(Gordon Moore),利用此半導體設備為其進行全基因組的定序,也讓摩爾成為第一個用非光學概念『Post-light sequencing』進行定序的人,此舉更為此研究創造許多新聞性的話題,此外,為了確認此項定序技術準確度,研究團隊也同時利用 SOLiD (Sequencing by Oligonucleotide Ligation and Detection)定序平臺,相互進行定序結果之驗證與實驗確效。

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    近年來,隨著醫學的深入研究,追溯其原因,發現遺傳性疾病大都與 DNA 有密切關係,因此,基因定序技術應用在特殊之醫療領域,儼然成為一種銳不可檔的趨勢,藉由 NGS 技術快速獲得序列資料,爭取分析罕見疾病的時效性,讓預防醫學能與時間競爭上占盡優勢。另一方面,NGS的足跡亦深入日常生活中,將協助人們尋求更具有效性的解決方案,而其技術門檻的不斷創新與突破,業已迎頭趕上並超越半導體行業的摩爾定律(Moore’s Law(圖六),本篇所簡介的半導體定序,不僅提供成本低,更快和更利攜帶之設備,而其所需負擔之價格也屢屢降低,未來1000美元解開基因組(The $1,000 genome)的願望,將不再是遙不可及的夢想。

20140403_7.jpg  (圖六)

 

 

參考文獻:

1. Hayden, E.C.2014Technology: The $1,000 genome. Nature. 507 (7492)294-295.

2. Rothberg JM, Hinz W, Rearick TM, Schultz J, Mileski W, Davey M, Leamon JH, Johnson K,      Milgrew MJ, Edwards M, Hoon J, Simons JF, Marran D, Myers JW, Davidson JF, Branting A, Nobile JR, Puc BP, Light D, Clark TA, Huber M, Branciforte JT, Stoner IB, Cawley SE, Lyons M, Fu Y, Homer N, Sedova M, Miao X, Reed B, Sabina J, Feierstein E, Schorn M, Alanjary M, Dimalanta E, Dressman D, Kasinskas R, Sokolsky T, Fidanza JA, Namsaraev E, McKernan KJ, Williams A, Roth GT, and Bustillo, J. 2011 An integrated semiconductor device enabling non-optical genome sequencing. Nature. 475 (7356)348-52.

 

 

 

 

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