在Ion torrent 定序平台中,要定序之前,要先做出成功的 emulsion PCR,才有可能有好的定序品質 , 但首先要克服以下情況:

        1.  Micro-reactor 必須有一致的大小 :

emulsion PCR 是利用油滴包覆Emulsion PCR 必須所含的物質,包含Bead、 一條 DNA template、d NTP、DNA polymerase、co-factor 等等。這樣的一個反應油滴我們稱之為 micro-reactor。一般而言,micro-reactor 的大小約在 20-30 um , 這樣的大小已經足以提供 Emulsion PCR 一個很好的反應環境。 micro-reactor 若是太大,就會容易造成 polyclonal 的形成 ( 即一個micro-reactor 裡面含有兩條不同的 DNA template,使同一個bead上會有兩種不同序列的 template,造成定序時判讀微弱或混亂 )。

micro-reactor 也不能太小,太小的反應空間雖然可以減少 polyclonal 的形成,卻會使一些emulsion PCR 所需的 co-factor 無法存在於micro-reactor 中,使的Emulsion PCR效率減低。

現有的Ion torrent 定序平台,是將油和水利用壓力通過孔洞小的filter,形成大小均一的micro-reactors。

 

2.  在高溫的PCR過程中,可以有穩定的乳化狀態(emulsion)。

Emulsion PCR 所形成之 micro-reactors ,可謂是水中有油,油中有水的乳化狀態,如下圖一。

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(圖一)

 

 理想的Emulsion PCR ,不應該為PCR 過程中的高溫被破壞其乳化狀態,所以其油的選擇是很重要的,油必須有耐熱性( thermostable) 。 因為水分子遇熱會有顫動導致泡泡的破裂,若油此時也在高溫之下一起不穩定,便容易使的 micro-reactors 漸漸地聚集成一個大的水滴,這樣的 micro-reactor 便因為太大而形成之前所提的polyclonal 形成條件之一 : 擁有兩條不同DNA template 的 micro-reactor。

 此外,要是micro-reactors 聚集的情況太嚴重,便會產生油水分離的狀態,例如圖二。

20140516_2  

(圖二)

 

另外,油和水的比例也是會不會造成油水分離的原因之一,以PGM為例,水和油的比例為1:4 是一個恰當的比例。 

1. PCR之後的beads 回收率。

Emulsion PCR時必須有耐熱性高的乳化狀態,但是這樣的穩定狀態在我們要回收 beads 時是一種阻礙,所以必須有好的detergent 將 micro-reactors 打破,卻又不傷及 DNA 。 醇類是一種好選擇, 以PGM為例, 是以丁醇 butanol 打破micro-reactors 然後將 beads 回收後以 SDS 清洗。

 

2. 減少在bead 回收時的粘著機率。

有時在回收 beads 會有 DNA 相互纏繞的現象,所以必須用detergent 將纏繞打開,不然也會造成定序的訊號混亂。當然,sonication 也是一個選擇,不過會傷害DNA 所以不太考慮。

 

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 參考文獻; Optimization and Improvement of Emulsion PCR for the Ion Torrent Next-Generation Sequencing Platform. (2011) Jimmy Perrott.

 

 

 

 

 

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