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圖一: circRNA的生成及功能(圖來源: Wilusz, J. E., and Sharp, P. A. (2013). Molecular biology. A circuitous route to noncoding RNA. Science 340, 440–441. doi: 10.1126/science.1238522 )

 

Circular RNAs (circRNAs) 是一種環型的noncoding RNA (ncRNA),早在1991年就有研究發現此類型的 ncRNA,但將近20多年來,人們對於circRNAs的了解依舊陌生,近兩年多篇研究使用NGS RNA-Seq的定序的技術,於哺乳動物細胞中找到大量的novel circRNAs,其研究成果也登上知名的期刊naturescience

circRNAs的生成機制及功能可由上圖一說明,左半部是基因於細胞核內經過轉錄生成mRNAcircRNA則是經過backsplice circularization形成環型的RNA mRNA在細胞質內可被microRNA與其3’UTR的區域鍵結導致mRNAdegrade無法轉譯成蛋白質(上圖左下方)circRNA則是能吸附microRNA (上圖右下方),使得mRNA不被microRNA鍵結抑制 (此機制稱為microRNA sponge) backsplice的意思是指exon相接時並未遵循exon的順序,如上圖舉例,exon 3號是回頭與exon2相接。

 

近兩年多篇研究讓我們對於circRNA的特性有更多的了解,相關的特性如下

  1. 1. circRNA在細胞中是非常的穩定,多數的半衰期其為48個小時,而mRNA10小時左右,但在血液中circRNA的半衰期不到15秒鐘。
  2. 2. 由於circRNAs沒有自由的5’3’ ribonucleotide 端,如要定序樣品的 library製備會使用 rRNA-depleted而非傳統真核細胞中常用的polyA-enriched
  3. 3. circRNA的生成backsplice circularization 會遵循canonical splice site,如同Pre-mRNAsplice site GT-AG GTdonor(intron5’)AGacceptor(intron3’),可參見下圖二

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圖二: pre-mRNAsplicingcircRNAbacksplice circularization上的相同之處  (圖來源: Sebastian Memczak et al., Circular RNAs are a large class of animal RNAs with regulatory potency. Nature 495, 333–338 (21 March 2013) doi:10.1038/nature11928 )

 

  1. 4. 目前發現在人類中找到的circRNA的上下游intron的區域發現有許多的ALU repeat
  2. 5. circRNA的生物功能已發現可和microRNA鍵結 (microRNA sponge),如CDR1asSry,下圖三A的部分;也發現可能與RNA-binding proteins(RBP)的運輸(delivery)儲藏(store),分類(sort)有關,並參與調控基因轉錄等功能,下圖三B的部分。

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圖三: circRNA的生成及調控示意圖 (圖片來源: Matthias W Hentze1 and Thomas Preiss2,* Circular RNAs: splicing’s enigma variations. The EMBO Journal (2013) 32, 923–9250)

 

William R. Jeck的研究中,提出了一種技術為CircleSeq的實驗及生物資訊流程來幫助找尋circRNA

流程一:下圖四A

做法上是將RNA samplelibrary 使用rRNA depletion處裡,在分為有使用RNase R digestion(RNase R+ RNA)及沒有使用RNase R digestion(RNase R- RNA)處裡的library進行Illumina paired-end定序

 

流程二:下圖四B

定序後的序列使用Mapsplice這套軟體找出reads有橫跨exon junction的可能性

 

流程三:下圖四C

RNase R- RNA處裡的結果為control組,alignment的結果為mRNA splicing的情形;而經RNase R+ RNA處裡的sample,挑出符合backsplicemapping情況,也可參見下圖五,paired-end reads會橫跨兩個exon。從這實驗組及對照組的reads coverage可看出基因(RefSeq Gene)上面的哪幾個exon會形成circRNA

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圖四: CircleSeq的實驗流程圖 (圖來源: William R. Jeck et al., Circular RNAs are abundant, conserved, and associated with ALU repeats. RNA. Feb 2013; 19(2): 141–157. doi:  10.1261/rna.035667.112 )

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圖五: 利用discordant/improperly  pair 所找到的circRNA (圖片來源: Julia Salzman et al.,Circular RNAs Are the Predominant Transcript Isoform from Hundreds of Human Genes in Diverse Cell Types. PLoS ONE 7(2): e30733. doi:10.1371/journal.pone.0030733)

 

當透過生物資訊的方法找出circRNAcandidates後,實驗的驗證可設計divergentprimer來調出產物(下圖i)William R. Jeck提出使用不同實驗方法驗證circRNA時預期的實驗結果(下圖六ii~vi)

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圖六: circRNA實驗驗證的預期結果 (圖片來源: William R Jeck & Norman E Sharpless. Detecting and characterizing circular RNAs. Nature Biotechnology 32, 453–461 (2014) doi:10.1038/nbt.2890)

 

 

Reference

  1. 1. Wilusz, J. E., and Sharp, P. A. (2013). Molecular biology. A circuitous route to noncoding RNA. Science 340, 440–441. doi: 10.1126/science.1238522
  2. 2. William R Jeck & Norman E Sharpless. Detecting and characterizing circular RNAs. Nature Biotechnology 32, 453–461 (2014) doi:10.1038/nbt.2890
  3. 3. Sebastian Memczak et al., Circular RNAs are a large class of animal RNAs with regulatory potency. Nature 495, 333–338 (21 March 2013) doi:10.1038/nature11928
  4. 4. William R. Jeck et al., Circular RNAs are abundant, conserved, and associated with ALU repeats. RNA. Feb 2013; 19(2): 141–157. doi:  10.1261/rna.035667.112
  5. 5. Julia Salzman et al.,Circular RNAs Are the Predominant Transcript Isoform from Hundreds of Human Genes in Diverse Cell Types. PLoS ONE 7(2): e30733. doi:10.1371/journal.pone.0030733
  6. 6. Matthias W Hentze1 and Thomas Preiss2,* Circular RNAs: splicing’s enigma variations. The EMBO Journal (2013) 32, 923–9250

 

 

 

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