過去的研究顯示,基因表現調控的方式與 DNA甲基化以及 histone modification 有重要的關係,但它們彼此之間是如何透過交互作用而調控基因表現卻不是十分充分的被研究。DNA的甲基化現象是經由 DNA methyltransferase 將甲基經催化反應標誌在 DNA 上,通常能抑制轉錄作用;而histone modification 後能改變 chromatin 結構進而影響基因表現,其中由 Polycomb-repressive complex 2 (PRC2) 中的 histone methyltransferase EZH2 催化 H3K27 甲基化形成的 H3K27me3,科學家們發現總是可在一部份被抑制的基因 promoter 上觀察到,因此,H3K27me3可能也與抑制基因表現脫離不了關係,在過去研究中也一直認為  PRC2  H3K27me3與抑制基因表現具關聯性 (圖一)

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圖一、各種催化 H3K27 甲基化的組蛋白最終造成終止轉錄反應

在癌症方面的研究,時常被提到與不正常的基因調控相關,若抑制 cancer cell 形成的基因,其 CpG island (CGI) promoter 被不正常的甲基化後抑制基因表現,可能為造成多種癌症的生成的原因之一。基於以上理由,科學家嘗試使用次世代定序中的 ChIP-bisulfite sequencing (ChIP-BS-seq),分析 normal 以及cancer cell的差異,針對 H3K27me3 附著 DNA 位置,企圖了解 H3K27me3 與其附著 DNA 甲基化之間的關係。步驟為:免疫沉澱回收後,進行一般 ChIP –seq library 的製備過程直到 ChIP DNA 兩端接上 adapter,然後再使用 sodium bisulfite 進行 C-T 轉化,轉化後的單股 DNA 進行 PCR 放大完成 library (圖二),由於 adapter 是完全被甲基化的設計,因此不用擔心被轉化的問題。定序後,我們可以將資料與不進行bisulfite 處理的 ChIP-seq 資料進行比較,也可以進一步在 cancer cell normal cell彼此間,進行差異性的比較。

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圖二、ChIP-bisulfite sequencing library 的製備方式,並使用針對甲基化抗體篩選 DNA 片段做為對照組。

定序分析後,比較 normal cell 以及 cancer cell 可以發現,雖然在非 CGIs promoter的位置上,兩者甲基化的差異並不大 (圖三),但在 CGIs promoter 的位置,很明顯的 cancer cell 甲基化的程度提高了許多。除此之外,分析不同種類、癌症來源的 cancer cell ,所獲得的甲基化程度有很大的差別,這顯示可能 H3K27me3 僅影響某一部份的癌症基因表現。統計在 normal cell 中非甲基化而 cancer cell 中高度甲基化的CGI promoter 下游基因 127 比對資料庫後發現,許多與細胞膜蛋白、離子傳遞、維持細胞內外調合平衡等等有關,這些都是過去被高度注視過與致癌基因或代謝相關的基因,而未被報導過的基因,很有可能具癌症研究價值而未來可再進一步研究。

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圖三、Cancer cell Normal cell CGI CGI promoter 位置甲基化的程度比較。

如同本篇一開始所提,一直以來 DNA 甲基化與某些 histone modification,均被認為與抑制基因表現相關,其代謝路徑過去被認為是分開獨立的,但在一般 normal cell 中很少看到 H3K27me3 附著 CGI promoter 位置同時被甲基化的,因此兩者可被認為彼此間是有拮抗關係地互相影響,當 DNA 甲基化能力被突變掉 (TKO) 後,原本 CGI 高度甲基化的部分會被 H3K27me3 取代抑制調控 (圖四左),不過單就 H3K27me3 而言,反之並不會增加 DNA 甲基化,可能有其他 modified histone 影響。過去針對這種拮抗作用為基礎,H3K27me3 DNA 甲基化在 cancer cell 改變的調控有其中一種假設認為,DNA甲基化取代 H3K27me3 抑制基因表現,而這種取代由於較 H3K27me3 更為穩固,因此基因在適當時機該表現卻無法表現 (圖五、A),如今將這個說法與 ChIP-bisulfite sequencing 後的結果比對可知,並不完全正確,因為 cancer cell H3K27me3 CPI 位置,相較於 normal cell 被大量的甲基化,cancer cell CGI 位置的基因調控表現顛覆了兩者間原本的拮抗理論,也因此我們也許能夠再次修正這個假設:cancer cell H3K27me3 CGI 位置同時被甲基化,而造成許多與癌症相關可被調控的基因完全被抑制,因此將來將可利用 CGI 位置同時觀察到 H3K27me3 及甲基化判斷,該細胞是否正要變成為引起癌症的 cancer cell

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圖四、Cancer cell Normal cell CGI CGI promoter 位置甲基化的程度比較。

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圖五 ADNA 甲基化在cancer cell上取代了 H3K27me3 形成更穩固的基因抑制現象。

參考文獻

 

1. Gao, F., Ji, G. et al., Direct ChIP-bisulfite sequencing reveals a role of H3K27me3 mediating aberrant hypermethylation of promoter CpG islands in cancer cells

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