作者：林佑軒/有勁生物科技

 

隨著天氣漸涼，逐漸進入流感盛行的季節，流感為急性病毒性呼吸道疾病，雖免疫力正常的人大多可在醫師的治療下痊癒，但重症者可能造成肺炎而危害到性命，加上有容易傳染散播的特性，所以仍不可輕忽。105年度的公費流感疫苗已於10月1日可開始於各醫院診所或衛生局洽詢施打，今年度針對免費施打對象有放寬條件，可到衛服部網頁進行查詢1。

流感病毒Influenza virus屬正黏液病毒科Orthomyxoviridae，其遺傳物質為單股負股RNA。在主要的分型上，分為A型、B型與C型流感。A型感染的對象為人或其他雞或鳥禽類，也是主要常見的感染種類，A型流感依據表面蛋白Hemagglutinin(HA)與Neuraminidase(NA)種類的不同，又可分subtypes為H1-H18及N1-11。B型感染的對象為人與海豹，較少單獨造成大規模的流感疫情，且與A型流感不同，B型流感並無HA與NA subtypes的分類。C型感染的對象為人與豬，相對於A型或B型流感更少見2。流感病毒難以防範的其中原因是病毒具有容易變異的特性，難以施打一種疫苗便能長期具有保護，變異的情況多為病毒表面的surface glycoprotein mutation或是不同strain間的基因相互重組(reassortment)，且其中A型流感能夠在人與雞鳥禽類共通傳染，又更增加其變異與傳染的能力3。

目前臨床上若發現病人具有類似流感的病徵，醫師常會使用快篩試劑快速判別是否為流感病毒，以即早給予患者克流感類的抗病毒藥物。快篩試劑組具有及短時間內可以獲得結果的優勢，然而，依據衛福部疾管署的研究4，對於部分病毒量較少的樣品，檢出率僅有50%，因此若需準確偵測病毒且分型，仍須仰賴RT-qPCR的方式，然而，一般的RT-qPCR僅能針對已知的病毒型做判斷，且不易得知病毒基因的變異狀況，若為新種的病毒，則仍然無法進行辨別。

有許多研究團隊以次世代定序技術建構流感病毒檢測平台5,6,7,8，因呼吸道刮棒沾有的病毒所萃取出的RNA不足以直接用來做定序使用，所以主要原理是利用RT-PCR的方式，設計與分型或病理抗藥性相關基因區域的primer，對樣品特定區域進行增幅，但因通常需要耗時的繁複步驟，且新變異的病毒也有可能無法在此技術中被檢測出，因此縮減其在臨床應用的可能性。

美國FDA的Zhao研究團隊9，設計特殊的primer組，其可不分病毒類型增幅出流感病毒所有RNA，其名為Universal RT-PCR assay，並配合產物amplicon的NGS定序分析，測試162個樣品，研究流程如圖一，作者先以Universal RT-PCR assay分類有或無明顯產物，依照不同的結果再搭配不同coverage criterion進行de novo 分析方法進行判別，發現此技術有99.4%的正確率，且能檢測出單一檢體有兩種subtype病毒的分型，如圖二。

圖一

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圖二

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在靈敏度方面，Universal RT-PCR assay在樣品稀釋10-7病毒量最低1.8X10-9 TCID50的狀況下，仍能在電泳下有清楚的呈現，如圖三，同樣的病毒量下，NGS技術也幾乎能定序到所有的流感病毒基因共8個基因的segment，如圖四。

圖三

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圖四

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而在實際的臨床呼吸道棉棒採檢樣品上，作者開發出的方式與其他現存的方式比較，分型的結果也都正確，代表性的樣品呈現如圖五，此結果及上述的數據驗證此方法具有高度靈敏度與正確性。

圖五

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此篇研究的樣品，依照序列的內容，雖無發現有不同strain基因重組的病毒樣品，但發現有些樣品在PB2 protein的基因具有突變型E627K，此突變型據研究指出，具有較高的病毒毒性，會造成患者有較嚴重的症狀，另外也有發現部分樣品在M2 protein基因有S31N的突變型，此型也是被認為具有抗藥性的病毒類型，如圖六，所以藉由分析序列，除了可以了解病毒型，甚至可以進一步分析病毒的特性。

圖六

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藉由全基因體的RT-PCR增幅，並配合NGS技術與分析，除了可以高度靈敏且正確獲得病毒分型的資訊外，也能透過分析病毒的基因組成，辨別病毒的毒性特性與抗藥性等性質，此除了對於臨床醫師應有相當程度的幫助外，對於病毒散佈的狀況及疫情的防範亦有應用的可能。

參考文獻

1. https://antiflu.cdc.gov.tw/

2. Hay AJ, Gregory V, Douglas AR, Lin YP. The evolution of human influenza viruses. 0962–8436 (Print). 1861–1870 p.

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4. 楊季融、郭權益、林昭樺、吳和生、劉銘燦 新上市流感快篩試劑之檢測效能評估 疫情報導 2014

5. de la Rosa-Zamboni D, Vazquez-Perez JA, Avila-Rios S, Carranco-Arenas AP, Ormsby CE, et al. Molecular characterization of the predominant influenza A(H1N1)pdm09 virus in Mexico,     December 2011-February 2012. PLoS One 7: e50116. doi: 10.1371/journal.pone.0050116. pmid:23209653

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9. Zhao J, Liu J, Vemula SV, Lin C, Tan J, et al. Sensitive Detection and Simultaneous Discrimination of Influenza A and B Viruses in Nasopharyngeal Swabs in a Single Assay Using Next-Generation Sequencing-Based Diagnostics. PLoS One. 2016 Sep 22;11(9):e0163175. doi: 10.1371/journal.pone.0163175. eCollection 2016.

 

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