隨著天氣漸涼,逐漸進入流感盛行的季節,流感為急性病毒性呼吸道疾病,雖免疫力正常的人大多可在醫師的治療下痊癒,但重症者可能造成肺炎而危害到性命,加上有容易傳染散播的特性,所以仍不可輕忽。105年度的公費流感疫苗已於101日可開始於各醫院診所或衛生局洽詢施打,今年度針對免費施打對象有放寬條件,可到衛服部網頁進行查詢1

流感病毒Influenza virus屬正黏液病毒科Orthomyxoviridae,其遺傳物質為單股負股RNA。在主要的分型上,分為A型、B型與C型流感。A型感染的對象為人或其他雞或鳥禽類,也是主要常見的感染種類,A型流感依據表面蛋白Hemagglutinin(HA)Neuraminidase(NA)種類的不同,又可分subtypesH1-H18N1-11B型感染的對象為人與海豹,較少單獨造成大規模的流感疫情,且與A型流感不同,B型流感並無HANA subtypes的分類。C型感染的對象為人與豬,相對於A型或B型流感更少見2。流感病毒難以防範的其中原因是病毒具有容易變異的特性,難以施打一種疫苗便能長期具有保護,變異的情況多為病毒表面的surface glycoprotein mutation或是不同strain間的基因相互重組(reassortment),且其中A型流感能夠在人與雞鳥禽類共通傳染,又更增加其變異與傳染的能力3

目前臨床上若發現病人具有類似流感的病徵,醫師常會使用快篩試劑快速判別是否為流感病毒,以即早給予患者克流感類的抗病毒藥物。快篩試劑組具有及短時間內可以獲得結果的優勢,然而,依據衛福部疾管署的研究4,對於部分病毒量較少的樣品,檢出率僅有50%,因此若需準確偵測病毒且分型,仍須仰賴RT-qPCR的方式,然而,一般的RT-qPCR僅能針對已知的病毒型做判斷,且不易得知病毒基因的變異狀況,若為新種的病毒,則仍然無法進行辨別。

有許多研究團隊以次世代定序技術建構流感病毒檢測平台5,6,7,8,因呼吸道刮棒沾有的病毒所萃取出的RNA不足以直接用來做定序使用,所以主要原理是利用RT-PCR的方式,設計與分型或病理抗藥性相關基因區域的primer,對樣品特定區域進行增幅,但因通常需要耗時的繁複步驟,且新變異的病毒也有可能無法在此技術中被檢測出,因此縮減其在臨床應用的可能性。

美國FDAZhao研究團隊9,設計特殊的primer組,其可不分病毒類型增幅出流感病毒所有RNA,其名為Universal RT-PCR assay,並配合產物ampliconNGS定序分析,測試162個樣品,研究流程如圖一,作者先以Universal RT-PCR assay分類有或無明顯產物,依照不同的結果再搭配不同coverage criterion進行de novo 分析方法進行判別,發現此技術有99.4%的正確率,且能檢測出單一檢體有兩種subtype病毒的分型,如圖二。

圖一

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圖二

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在靈敏度方面,Universal RT-PCR assay在樣品稀釋10-7病毒量最低1.8X10-9 TCID50的狀況下,仍能在電泳下有清楚的呈現,如圖三,同樣的病毒量下,NGS技術也幾乎能定序到所有的流感病毒基因共8個基因的segment,如圖四。

圖三

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圖四

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而在實際的臨床呼吸道棉棒採檢樣品上,作者開發出的方式與其他現存的方式比較,分型的結果也都正確,代表性的樣品呈現如圖五,此結果及上述的數據驗證此方法具有高度靈敏度與正確性。

圖五

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此篇研究的樣品,依照序列的內容,雖無發現有不同strain基因重組的病毒樣品,但發現有些樣品在PB2 protein的基因具有突變型E627K,此突變型據研究指出,具有較高的病毒毒性,會造成患者有較嚴重的症狀,另外也有發現部分樣品在M2 protein基因有S31N的突變型,此型也是被認為具有抗藥性的病毒類型,如圖六,所以藉由分析序列,除了可以了解病毒型,甚至可以進一步分析病毒的特性。

圖六

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藉由全基因體的RT-PCR增幅,並配合NGS技術與分析,除了可以高度靈敏且正確獲得病毒分型的資訊外,也能透過分析病毒的基因組成,辨別病毒的毒性特性與抗藥性等性質,此除了對於臨床醫師應有相當程度的幫助外,對於病毒散佈的狀況及疫情的防範亦有應用的可能。

參考文獻

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