DNA 的甲基化現象研究一直以來是個熱門的話題,脊椎動物最常發生在CpGCytosine的五號碳上,植物或是哺乳類動物幹細胞上則常見發生在 CHGCHH上。當甲基化的位置在promoter上時,通常會 down-regulate 下游基因表現,這種基因調控的功能,與多種細胞分化、抗腫瘤基因、生長發育等等相關。

近年來使用次世代定序儀技術發展了數種研究DNA 的甲基化現象的方式,分別是使用 Bisulphite conversion 特性進行全基因體定序的 whole-genome bisulphite sequencing (WG-BS)、使用 probe 附加 target enrichment bisulphite sequencing (Targeted-BS)、使用抗體針對甲基化區域做免疫沉降的 methyled DNA immunoprecipitation sequencing (MeDIP-seq)及將 Bisulphite conversion 特性與抗體做免疫沉降混合的 methyled DNA immunoprecipitation bisulphfite sequencing (MeDIP-BS) (圖一)

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圖一、四種在次世代定序儀上研究 DNA甲基化現象的實驗流程。

那麼這四種定序方式各有甚麼優缺點呢?如大家可想而知的,WG-BS 可以高解析度的呈現方式將全基因體上的所有甲基化的碳標示找出並進一步分析,然而若將這種技術應用到大規模的醫學檢體樣品檢測,則相當沒有效率且所費不貲。針對此不便而孕育而生的技術是Targeted-BS,針對基因體中有興趣的片段用 probe 進行 enrichment,定序的資訊呈現明顯的 narrow down,可增加定序深度同時提供高解析度的甲基化位置資訊,然而面對沒有 reference genome 的物種,仍舊派不上用場,並且可能流失掉一些非 targeted 的甲基化資訊。Weber M. 等人在 2005 年發展出能夠針對 DNA甲基化 Cytosine 反應的抗體,這項技術的出現,使得即使沒有 reference genome 的物種,也能夠以 narrow down 進而 enrichment 的方式進行研究,而不用擔心錯失未知的甲基化資訊,雖然如此,在增加定序深度的同時卻無法提供高解析度甲基化資訊,僅能猜測定序結果中的 Cytosine 位置猜測可能甲基化的結果。科學上這種不確定假設很容易站不住腳,MeDIP-BS 技術可說是將上述的技術集大成而產生,通時兼備定序深度夠深、高解析度、並且保留不論已知未知的甲基化資訊,以下就以定序結果來證實這一點。

 將同樣來源的樣品以上述四種 library 製備方式定序後,將 WG-BS 的甲基化分佈結果做為最接近真實的 positive control 而與其他三種定序方式做比較,結果如下圖二,TOP 10% 高度甲基化的相似度而言,MeDIP-seq 因解析度不足僅有 35.3%Targeted-BS 則是 64.8%MeDIP-BS 可達 70.2%,後續 TOP 20%30% 雖然沒有圖示,但其結果仍是延續的。

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圖二、比較結果可看見 WG-BS MeDIP-BS 的甲基化判讀結果最為相似。

當我們另外挑選幾段promoter CpG 位置來放大檢視,下圖三ABC所挑選的區域是高度被甲基化的基因 promoter (NIFKPERM1AGRN),圖三D則是較低度被甲基化的基因 promoter (KCNIP2),很明顯的,雖然 MeDIP-seq 定序到的區域與其他差異不大,都若論能高解析度的得知是哪些 CpG 位置被甲基化馬上就出局了,而在圖三ABD NIFKPERM1KCNIP2 部分,雖然我們可以看到 WG-BSTargeted-BSMeDIP-BS 的差異並不明顯,但當看到圖三C AGRN部分時,很明顯的 Targeted-BS 的製備方式錯失掉了這些基因,原因很有可能就像前面提到的,probe 設計不夠完整,再次證明 WG-BS MeDIP-BS 的甲基化判讀結果最為相似的事實。

NGS 技術與 epigenomic 的研究依舊是目前熱門的話題,當然隨著定序的成本降低,whole genome 的定序負擔漸漸的降低,但在面對大規模的醫學檢體樣品時目前還是很大的挑戰,因此本偏另外探討的另外三種為了研究 epigenomic 而設計不同製備library 的方式並加以探討優劣,希望這項藉由結果的呈現,MeDIP-BS 會成為大家的好選擇。

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圖三、將甲基化的基因 promoter (NIFKPERM1AGRNKCNIP2) 在四種製備方式中的定序結果做高解析度的比較。

參考文獻

Jeong, H.M., Lee, S., Chae, H. et al. Efficiency of methylated DNA immunoprecipitation bisulphate sequencing for whole-genome DNA methylation analysis. Epigenetics 8(8), 1061-1077 (2016)

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