作者:劉祥欽/有勁生物科技

 

細胞核中的DNA會與histone (一種蛋白質) 纏繞而形成一種稱作chromatin的DNA-蛋白質複合結構,這種結構包含DNA與histone纏繞形成的nucleosome球狀體與連接其間的DNA,因此外型就像一串超長珠鏈。細胞死亡後,chromatin會被Caspase-Activated DNase (一種分解DNA的酵素) 從nucleosome間的連結位置切開而形成長度約166bp左右的片段,並游離到血漿中。這些在血漿中、長度相仿的DNA片段被稱為cfDNA (cell free DNA)。

 

人體內有腫瘤細胞繁衍時,死亡破裂的腫瘤細胞同樣也會釋放出游離的DNA,這類來自腫瘤細胞的DNA片段被特別定義為ctDNA (circulating tumor DNA)。晚期癌症病患血液中的cfDNA,可能有高於10%都是來自腫瘤細胞的ctDNA;而早期癌症病患血液內的cfDNA,ctDNA的佔比卻可能未達1%。不管來自一般細胞或是腫瘤細胞,其游離DNA的序列基本上都是一樣的,但在一些特別的位置,例如造成細胞癌化的突變位點,還是可以藉由定序找出差異。由於這些變異點位可能帶有與腫瘤相關的重要資訊,科學家們希望能藉由辨識這些變異點來發展可檢測早期癌症的新方法。然而,越是癌症早期ctDNA佔比越低的特性,讓這種檢測被實現的困難度提升了許多。

 

最近這幾年,開始有研究者發現來自癌細胞的ctDNA其平均長度可能比一般cfDNA來得短1-4。這個發現啟發出利用長度篩選來放大ctDNA在cfDNA中的佔比,讓癌症早期檢測變成可行的想法。在一篇今年甫出爐尚未被期刊審核刊登的文章 (unpublished preprints) 中5,作者以實驗方法嘗試驗證,利用長度篩選法只留下「較短的cfDNA」,是否能提高ctDNA的占比。首先,他們移植了人類卵巢癌細胞到小鼠身上,因為來自人類癌細胞的ctDNA與來自小鼠的cfDNA很容易從不同物種間基因序列的差異而區別出來,所以它們的長度可以分別被統計與比較。作者發現來自人類癌細胞,長度介於90-150 bp之間的ctDNA皆明顯短於平均長度落在166 bp的正常小鼠cfDNA。

 

在這個實驗條件下,作者利用自動電泳篩選系統 (PippinHT, Sage Bioscience) 對來自13個卵巢癌病患的26個帶有ctDNA的cfDNA樣品 (化療前及化療後數周的樣品各一) 進行長度篩選,並分別對篩選前後的樣品做定序分析。癌細胞的基因組經常被發現有基因套數異常的現象 (Somatic copy-number aberration, SCNA),因此量測cfDNA中基因套數發生異常的序列所佔比例,可以用來估計ctDNA含量的變化。但由於化療會殺死部分癌細胞,所以原本在化療前很容易被觀察到的基因套數異常情形也會因癌細胞數量減少而降低。然而,經過長度篩選後,因為選擇性篩選了「短cfDNA」,使得篩選後的ctDNA含量佔比提高,因而讓基因套數異常的比例跟著被放大,其放大幅度約在5至11倍之間。一些與癌化程度相關的基因位置如 NF1PARP2MYC ,在長度篩選後也被找到原本沒被發現的套數異常現象。以上結果顯示,增加長度篩選這個步驟可以讓ctDNA的偵測變得更容易,進而提高早期癌症檢測與預後追蹤的靈敏度。

 

由於每種癌症的形態各異,因此這種長度篩選法對不同部位癌症的適用性也需要個別進行評估。此外,因為從胎兒來的cfDNA也有較短的現象,此篩選法是否也可用來放大胎兒cfDNA在孕婦血液中的比例,讓某些因胎兒cfDNA佔比太低而難以進行的非侵入性產前染色體檢測 (Non-Invasive Prenatal Testing, NIPT),變得更加容易,這方面也值得我們進一步測試及驗證。

 

參考文獻:

1       Underhill, H. R. et al. Fragment Length of Circulating Tumor DNA. PLOS Genetics 12, e1006162, doi:10.1371/journal.pgen.1006162 (2016).

2       Jiang, P. et al. Lengthening and shortening of plasma DNA in hepatocellular carcinoma patients. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 112, E1317-E1325 (2015).

3       Mouliere, F. & Rosenfeld, N. Circulating tumor-derived DNA is shorter than somatic DNA in plasma. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 112, 3178-3179 (2015).

4      Mouliere, F. et al. High fragmentation characterizes tumour-derived circulating DNA. PLoS One 6, e23418 (2011).

5       Mouliere, F. et al. Selecting Short DNA Fragments In Plasma Improves Detection of Circulating Tumour DNA. bioRxiv, 134437 (2017).

 

 

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