NIPT偽陽性與偽陰性的可能原因 @ 有勁的基因資訊

作者：林佑軒/有勁生物科技

我們知道NIPT是不具侵入性且具高準確度的染色體套數篩檢技術；目前台灣大部分醫院或婦產科診所幾乎都有提供NIPT服務，且各家服務實驗室所提供報告的準確性皆達99%以上，孕婦媽媽們幾乎都能方便又安心的選擇這項新型態的篩檢服務。然而，即便NIPT準確性很高，全球醫師與學者大多將NIPT功能定位為篩檢 (screening)而非診斷 (diagnostic)；意即，篩選報告顯示染色體套數非常可能異常的孕婦媽媽，仍需要進一步做侵入性檢測 (羊膜穿刺/絨毛膜取樣) 以最後確診，因此NIPT報告並不能當作醫師確診的唯一依據。研究報告指出，NIPT篩檢結果顯示為高度風險的案例中，染色體套數最後亦被確診為異常的佔四到九成¹；由此可見，NIPT結果為陽性者，還是有搭配後續侵入性檢測的必要性。反之，雖然發生機率極低，NIPT仍可能出現偽陰性結果，這種狀況，除了可能會延誤早期確診，之後才發現問題，對孕婦及其家人更是難以接受。

那麼，究竟NIPT檢測為何會出現偽陽性或偽陰性結果？目前為止，已被釐清的原因包括：染色體嵌合現象 (mosaiciam)、雙胞胎一胎凋亡現象 (vanishing twin)、孕婦自身染色體拷貝數變異 (copy number variations; CNV)、孕婦本身罹患癌症 (maternal malignancy)、孕婦血漿含胎兒游離DNA比例偏低 (low fetal fraction)等。

染色體嵌合現象 (Mosaiciam)

受精卵分裂過程中的有絲分裂發生錯誤，導致染色體套數出現非整倍體，使得受精卵所分裂出的細胞群中，有一些細胞的染色體套數正常，另一些則異常，胚胎因此同時帶有型態正常與異常的細胞，這種狀況稱為mosaiciam。如下圖一所示。

有勁部落格《淺談非侵入性產前染色體檢測之胎兒DNA》曾提到：胚胎外層分化成的滋胚層在凋亡之後，游離出來的胎兒DNA會被釋放到孕婦血漿中，因而被NIPT選作分析標的。圖一的胎盤特異性嵌合體 (CPM)狀況發生時，由於滋胚層夾雜著染色體套數異常的細胞，NIPT篩檢結果因此會顯示高度風險，然而胎兒本身的染色體套數其實卻是正常的，這便是偽陽性結果。反之，當圖一中真性胚胎嵌合體 (TFM)狀況發生時，由於滋胚層的細胞染色體都正常，NIPT結果也會顯示低度風險，但胎兒染色體套數實際上卻異常，此便是偽陰性結果。研究指出染色體嵌合 (mosaiciam)的發生機率約有1%~2%²，這種自然的生物現象相對發生率實在不算低，因而被認為是造成NIPT偽陰性與偽陽性結果最有可能的原因。

圖一、圖中綠色代表正常的細胞，其他顏色代表各種不同染色體異常狀況的細胞。隨著細胞不斷分裂與分化，染色體異常的細胞有可能會全數自行凋亡，如圖一 (a)。染色體異常的細胞最終也有可能散佈在胚胎的內層與外層，導致胎兒部分細胞出現染色體套數異常，如圖一 (c)。另一種情形是染色體有異常的細胞全部分化至胚胎的最外層，這種狀況被稱為胎盤特異性嵌合體 (confined placental mosaicism; CPM)，如圖一 (b)。此外，若染色體異常的細胞全部分化至胚胎內層，則稱為真性胚胎嵌合體 (True fetal mosaicism; TFM) 或稱胚胎特異性嵌合體 (confined fetal mosaicism; CFM)。

雙胞胎一胎凋亡現象 (Vanishing twin)

Vanishing twin是指雙胞胎其中一個胚胎中途凋亡，最終僅剩一個胚胎長成完整胎兒。該中途凋亡的胚胎其游離DNA能存留於孕婦血漿中多久尚無定論，但曾有研究指出³至少會殘留8週左右。一旦凋亡胚胎的染色體套數有異常，其游離DNA便可能一併被NIPT定序進去，因而產生偽陽性結果。除此之外，若vanishing twin發生在原雙胞胎為一男一女的狀況下，NIPT也有可能因此錯誤判斷存活的那個胎兒的性別。有研究統計，vanishing twin發生率僅有0.23%，因此由vanishing twin所造成的NIPT偽陽性結果發生機會，也相對較低。

孕婦自身染色體拷貝數變異 (Copy number variations;CNV)

孕婦本身的特定染色體 (尤其是第13、18、21號染色體)有長片段的拷貝數變異─意即這些染色體上的某些區域重複出現多個複本，這種狀況下，母體自身游離DNA中的這些特定染色體片段比例就可能較一般人更多，使得NIPT在分析時誤以為這些特定染色體片段來自染色體套數異常的胎兒游離DNA，而顯示高度風險，產生偽陽性結果。在所有已知的偽陽性成因中，此原因發生的比例最高 (如圖二)。

圖二、總共206個NIPT結果錯誤的案件中，包含了182個偽陽性與24個偽陰性，其中能追蹤出造成錯誤結果的原因比例分別為33%與54%。這些原因中，造成偽陽性比例最高與次高的原因分別為48%的Maternal CNV與32%的CPM ; 而造成偽陰性的原因，則主要為TFM (CFM)。

孕婦本身罹患癌症 (Maternal malignancy)

有報告指出，癌細胞染色體套數多為異常，其游離DNA也可能被釋放至血漿中。當孕婦罹患癌症時，血漿中的游離DNA除了孕婦與胎兒的正常游離DNA外，也會夾帶這些染色體異常的癌細胞游離DNA，因此常導致NIPT產出偽陽性結果⁴。

孕婦血漿含胎兒游離DNA比例偏低 (Low fetal fraction)

影響孕婦血漿中胎兒游離DNA含量多寡的確切因素目前尚未知，然而一般認為與懷孕週數與孕婦體重較有關⁵。另也有研究指出，人工受孕的孕婦，其血液中胎兒游離DNA會較一般正常受孕的孕婦低⁶。當孕婦血漿中胎兒游離DNA比例過低 (低於4%時）⁷，NIPT定序到的游離DNA幾乎都源自染色體套數正常的孕婦，因此當胎兒染色體套數有異常時，過低的存在比例可能會讓NIPT無法正確判讀，而產出偽陰性結果。

上面圖二比較了約200個NIPT偽陰性與偽陽性案例的成因，發現源於mosaiciam與CNV的比例較高。值得注意的是，仍有近七成偽陽性 (67%)與近半數偽陰性 (46%)案例無法由目前已知的任何可能原因作解釋；換句話說，還有很多成因尚待研究。

影響NIPT篩檢結果的因素，除了檢測方法本身的靈敏度與準確度及實驗操作上的人為錯誤外，上述各種自然生物現象也有影響。孕婦在選擇染色體套數檢測項目前，醫師或諮詢師應該為其將各種方法的優點與限制清楚說明，由孕婦意願配合醫師專業判斷來決定出適當的檢測方法。

最後，如同今年一則文獻評論所述²，目前國際上尚未針對提供NIPT檢測服務的實驗室制定標準的服務規範，亦尚無能夠主導NIPT品質保證與分級的機構；各實驗室品質的監控，僅能由各實驗室自行控制與確認。未來勢必需要一個特定國際組織來訂出一套NIPT服務實驗室的品質標準並實施鑑定，讓孕婦在選擇NIPT篩檢時能更加安心。

參考文獻：

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2. Hartwig TS, Ambye L, Sørensen S, Jørgensen FS. Prenat Diagn. Discordant non-invasive prenatal testing (NIPT)-a systematic review. 2017 Jun; 37(6):527-539.
3. Curnow KJ, Wilkins-Haug L, Ryan A, et al. Detection of triploid, molar, and vanishing twin pregnancies by a single-nucleotide polymorphism based noninvasive prenatal test. Am J Obstet Gynecol 2015; 212(1):79.e1-79.e9.
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