有勁的基因資訊

作者：林佑軒/有勁生物科技

日常生活中，我們去金飾店購買以重量計價的金飾時，要如何確認同一金飾在不同店家其秤重結果會一樣？店家的電子秤通常都已經過砝碼校正確認，而這些砝碼本身也都校正過並確認對應符合國際度量衡局的標準重量，所以使用經砝碼校正後的電子秤，不論何處買的金飾，店家皆應能提供公正的重量及售價。在NGS應用領域中，是否也有類似砝碼那樣的校準物可參考呢?

科學上對角色功能類似砝碼的標準品，我們稱之為參考標準品(reference standards)。臨床醫學上，檢驗結果會影響醫師最終的判斷與處置，因此參考標準品在確認檢驗結果的正確性時是必要的存在。參考標準品必須是高度穩定的物質，在通過各種不同檢測方法針對其特性作分析之後，才能提供给合適的疾病或變異作為檢驗的校準參考。

NGS近年來開始被應用於臨床檢測上，因此參考標準品也被用來作為確認正確性的標準。然而，NGS有別於傳統醫學檢驗「一個項目僅檢測一種疾病」，它可以快速定序出數百萬個DNA序列，一次檢測數十甚至上百個疾病基因位點，因此想找到穩定且所有基因型皆已被定序確認的參考標準品相對更困難。

Hardwick等學者在Nature Review Genetics 發表的文章中，特別將能使用在NGS的參考標準品做了詳細整理¹。參考標準品在NGS的臨床應用上，除了可評估檢測結果的正確性外，對於覆蓋度(coverage)是否充足、定序錯誤(sequencing error)比例的評估，甚至整個檢測流程的量測不確定度分析皆可提供相當大的幫助。

在討論如何選擇合適的NGS參考標準品之前，有一點很重要需要先了解：參考標準品必須兼具待驗樣品的可代替性(commutability)，意即除了可用來比對的特質外，參考標準品的其他特性必須盡可能與待驗樣品相同；如下圖一所示。圖一a的x軸與y軸代表分別使用兩種不同NGS定序平台產生的檢測結果，圖中可見藍色實心圓點所代表的標準品與病人樣品(紅色實心圓點)的檢測結果較為相近，而藍色空心圓圈所代表的另一個標準品其檢測結果則已偏離趨勢線；這代表空心藍圈標準品的特質與這裡的待驗樣品不同，因此不具可替代性，不適合作為該樣品的參考標準品。圖一b，作者比較了作為參考標準品的兩個非比對用基因位點，x軸與y軸分別是兩個不同位點，圖中空心綠圈已偏離待驗樣品特性，因此也不適合做為參考標準品。值得注意的是，曾有研究團隊於臨床實際案例中發現：經福馬林固定石蠟包埋(FFPE, formalin-fixed paraffin-embedded)處理過的參考標準品，在不同程度的固定(fixation)下，原本具備待驗樣品可替代性的參考標準品有可能會因此失去替代性²。

圖一、待驗樣品的可代替性

(圖片來源：Hardwick, S.A. et al., Nat Rev Genet. 2017 Aug;18(8):473-484.)

參考標準品的可替代性確認之後，現在來看NGS臨床檢驗可使用的參考標準品及其使用方法。圖二將參考標準品分為三大類：(a) spike-in controls、(b) Biological reference materials、(c) in silico libraries。

圖二、NGS流程中使用參考標準品的示意圖

(圖片來源：Hardwick, S.A. et al., Nat Rev Genet. 2017 Aug;18(8):473-484.)

Spike-in controls(添加標準品)為人為合成的已知序列DNA或RNA片段。測試前先將特定比例的添加標準品加到樣品內，定序後經過基因庫建構(library construction)等等處理程序，之後便可確認這些參考標準樣品在通過重重過程後是否仍可定序出與預期相符的序列。DNA類別的定序，透過調整混入的添加標準品比例，可人為製造出有拷貝數變異(copy number variant)的樣品，以助了解檢測方法的正確性；或是模擬出低變異對偶基因頻率(low variant allele frequency)樣品，藉由使用混有不同比例的變異對偶基因(variant allele)而成的梯度參考物質(reference ladders)，進而對整個檢測方法的極限進行偵測³。RNA定序應用則常會比較不同條件下基因的表現量；分析這些表現量之前，定序出的片段必須先經過標準化(normalization)處理，去除因定序量或基因長度等與實驗條件無關等外在因素所造成的差異後，才能客觀比較基因在不同條件處理後的表現量差異。如圖三，若把所有被定序到的序列片段直接拿去進行標準化，由於每個基因的序列長度不同，標準化之後出現了偽陽性(FP: false positive)或偽陰性(FN: false negative)的結果(如圖三b)；假如在實驗之前先於各實驗組中加入特定量的添加標準品作為標準化的參考依據，便可正確比對出不同實驗樣品間真正的基因表現量，如圖三c。

圖三、利用添加標準品進行標準化

(圖片來源：Hardwick, S.A. et al., Nat Rev Genet. 2017 Aug;18(8):473-484.)

Biological reference materials(生物材料參考標準樣品)使用了完整的基因體或轉錄體作為參考標準樣品。為確保這些基因體與轉錄體可被持續提供且一直保有高度穩定性，這類參考標準樣品大多萃取自可持續穩定培養的細胞株。基因體參考標準品用來比對的基因位點皆已事前透過桑格定序法(Sanger sequencing)或其他基因型鑑定(genotyping)方法確認完成；而轉錄體參考標準品，則會以即時聚合酶鏈鎖反應(Real Time PCR)等RNA定量的方法來確認其比對基因的表現量。一些較罕見疾病的參考標準樣品，可利用基因編輯過的改造細胞株(genetically engineered cell lines)作為萃取參考物質的來源。而對於微生物的總體基因體定序(metagenomic sequencing)結果正確性的確認，則可將不同種微生物的基因體以特定比例進行混合，人為製造出微生物群參考標準品(Reference standards for microorganisms)。

生物材料參考標準樣品的應用，以基因體參考標準樣品為例，其主要功能是確認檢測多位點基因變異的正確性(如圖四)。假設今日要針對定序出來的單核苷酸變異(single nucleotide variant; SNVs)進行確認，在與參考標準樣品的預期結果比較後，實際結果一般來說可依照SNVs數量歸類出以下幾種：真陽性(TP: true positive)、真陰性(TN: true negative)、偽陽性(FP: false positive)、偽陰性(FN: false negative)；經過換算，最後便可得知該檢測流程的靈敏度(sensitivity)、特異性(specificity)、準確度(accuracy)、精確度(precision)等數值，提供醫師或受檢者該檢測結果的可信度參考。

圖四、基因體參考標準品用來評估檢測方法的正確性

(圖片來源：Hardwick, S.A. et al., Nat Rev Genet. 2017 Aug;18(8):473-484.)

In silico libraries(電腦模擬定序資料庫)，此類別參考標準品並非實體樣品，也未經實驗測試，而是以生物資訊方法用電腦模擬產生出來的定序資料，因此無法取代前述兩種參考標準樣品。由於現今有許多分析軟體可方便快速地產出各種異常基因型資料，就演算法開發的目的來說，這類型的資料可用來幫助確認演算法的可行性。應用過程上來說，可以先排除實驗操作過程的變異，單純就演算端進行方法確認，待演算法確認完成，再使用實體的參考標準樣品去進行實驗端的確認。

綜合上述三大類別的參考標準品，圖五列出了各類別的更細部分類、目前已用在NGS評估的參考標準品案例、以及優缺點的詳細評估。每個種類的參考標準品各有優缺點，適合用來評估的技術也略有不同，使用兩種以上的參考標準品進行評估能取得互補效益，對於方法正確性或方法開發的評估，分析方式上會更完整。

圖五、NGS會使用到的幾種主要參考標準品列表

(圖片來源：Hardwick, S.A. et al., Nat Rev Genet. 2017 Aug;18(8):473-484.)

NGS要應用到臨床檢測，如須向FDA申請作為體外診斷檢測(in vitro diagnosis test)，或向CLIA (Clinical Laboratory Improvement Amendments)申請認證實驗室時，皆會被要求提供使用參考標準品進行完整方法確認的結果報告^4,5。NGS不斷有新型檢測技術開發出來，現有參考標準品也有可能漸漸出現評估上的極限，所以除了開發新技術，新型態標準參考物質的研究也相當重要。方法評估唯有完整，才能讓醫師及受檢者都能對採用檢測結果進行後續臨床處置更有信心。

參考文獻

1. Hardwick, S.A., Deveson, I.W., Mercer, T.R. Reference standards for next-generation sequencing. Nat Rev Genet. 2017 Aug; 18(8):473-484.

2. Singh, R.R. et al. Clinical validation of a next-generation sequencing screen for mutational hotspots in 46 cancer-related genes. 2013 Sep; J. Mol. Diagn. 15(5), 607-622.

3. Deveson, I.W. et al. Representing genetic variation with synthetic DNA standards. 2016 Sep; Nat. Methods 13(9), 784-791.

4. Centers for Medicare and Medicaid Services. US Department of Health and Human Services. Part 493─Laboratory Requirements: Clinical Laboratory Improvement Amendments of 1988. 42 CFR §§493.1443-1493.1495.

5. Gargis, A.S. et al. Assuring the quality of next-generation sequencing in clinical laboratory practice. 2012 Nov; Nat Biotechnol. 30(11):1033-1036.