作者:吳上豪/有勁生物科技

 

Flow cell是含有管道的一片玻璃,能提供空間給定序樣品在其中擴增產生叢集(cluster),可說是Illumina定序的主要舞台;定序試劑在玻璃上的管道內流通,而定序便靠著偵測辨認各叢集所放出的螢光訊號來進行(請參考有勁部落格文章《次世代定序(Next Generation Sequencing, NGS)》)。Illumina於2014年推出patterned flow cell技術1並將之應用在HiSeq X ten、HiSeq 3000、HiSeq 4000等較新的機型,降低了定序的成本。Patterned flow cell的特性,以及與舊式flow cell (non-patterned flow cell)之間究竟有何差異?本篇文章這就帶您了解。

 

舊式flow cell可用在MiSeq、HiSeq 2000/2500等機型上;定序樣品隨機散落在flow cell上進行橋式聚合酶鏈鎖反應 (bridge PCR),其叢集擴增進行的過程好比放牛吃草,產生出來的叢集大小均不相同,有時還會互相重疊(如圖一所示)2。HiSeq 2500平台進行定序時,在第5個鹼基定序完成之後,會藉由偵測前5個鹼基的訊號,再花一個多小時去定義叢集的位置。此外,舊式flow cell需要注意定序樣品的上機濃度,上機濃度若過高,有可能造成叢集形成密度太高,各個叢集的位置因此無法被定義出來,定序結果就被儀器判定為「品質不良」,訊號因而被濾除。反之,若定序樣品上機濃度過低,則有可能造成定序資料量的不足。因此,調整出樣品最適的上機濃度才能確保定序的成功;這對實驗操作者來說,需要相當的經驗累積才能做到。

 

 

圖一、Non-patterned flow cell定序時的叢集(cluster)生長擴增示意圖

180524_1.png

圖片來源:Illumina, Inc. (2015) Calculating Percent Passing Filter for Patterned and Nonpatterned Flow Cells.

 

相對地,Patterned flow cell則是在管道中設計了數以億計奈米級的小格子 (nanowell),提供定序樣品擴增的空間(如圖二所示)2,3。定序樣品與nanowell中的探針一旦雜合就會馬上進行擴增;由於樣品與探針的雜合,其速率遠低於樣品與探針雜合之後的擴增速率,因此同一格子中出現多種樣品擴增叢集的機會便可大大減少。為了Patterned flow cell,Illumina還配合其所使用的叢集合成方式,更新了試劑系統,讓定序成本降低,花費時間縮短;所以,對HiSeq 3000/4000/X機型來說,操作流程只要確認小格子內是否有螢光訊號傳出即可,不再像舊式flow cell那樣要去定義叢集的位置,定序時間減了不少。此外,由於各叢集的生長空間被小格子「規劃」好了,因此比較不需要擔心上機濃度過高造成失敗的可能性;同時還可以好好利用flow cell整片玻璃的空間,增加定序產出的資料量。

 

 

圖二、Patterned flow cell與定序時的叢集(cluster)生長擴增示意圖

180524_2.png

圖片來源:Illumina, Inc. (2015) Patterned Flow Cell Technology.

 

 

由此可見,Patterned flow cell比起non-patterned flow cell,有著更高的資料產出量、更低的定序成本需求、更快的定序速度。看起來雖然好處多多,但Patterned flow cell並非完美,仍有一些需要特別注意的事項。在此先賣個關子,下回筆者的文章中再來說明,敬請期待。

 

 

參考資料

1.Hayden E.C. (2014 Jan 15) Is the $1,000 genome for real? Nature News. doi:10.1038/nature.2014.14530

2.Illumina, Inc. Technical Note: Informatics. (2015) Calculating Percent Passing Filter for Patterned and Nonpatterned Flow Cells - A comparison of methods for calculating percent passing filter on Illumina flow cells.

3.Illumina, Inc. Technical Spotlight: Sequencing. (2015) Patterned Flow Cell Technology - Fixed spacing of sequencing clusters with defined feature sizes contributes to increased data output, reduced costs, and faster run times.

 

 

官網用CC創用_SA.png

文章標籤
創作者介紹
創作者 YourGene 的頭像
YourGene

有勁的生技資訊

YourGene 發表在 痞客邦 留言(0) 人氣()