作者:劉祥欽/有勁生物科技

 

  血漿中游離DNA (circulating cell-free DNA) 的特性及來源漸為人們熟知後,其在檢測監控上的應用於近幾年不斷地被開發出來。「每個人血液中都有自己的游離DNA」已然成為老生常談;但「孕婦、癌症病患以及器官移植接受者血液中帶有胎兒、癌細胞或被移植器官的DNA」這個事實,可就讓研究者大大睜亮眼睛了。而以此為研究基礎,至今也已研究發展出非侵入性產前檢測 (NIPT)、癌細胞液態檢體 (liquid biopsy)與移植器官的監控與損害評估等技術。

 

  游離DNA會片段化,但片段化的長度並非隨機決定,而是有其特定偏好,且這長度與nucleosome (核小體)結構很有關聯。因為比起纏在nucleosome core(核小體核心)上的DNA,linker(連接子) DNA更易被切斷,所以游離DNA長度一般約莫是兩個linker的距離。有趣的是,從胎兒來的游離DNA (主要來自胎盤)長度較短,這個特性現雖已被應用在估計胎兒DNA比例 (fetal fraction)以及偵測胎兒非整倍染色體上,但至今大家對這背後所牽涉的分子機制卻仍多有不解。

 

  雖然已有研究指出來自媽媽與來自胎兒的游離DNA其在整個基因體上的斷點位置各自有著不同偏好,但至於為何如此這般卻無明確解釋;此外,對斷點位置的不同偏好是否跟胎兒DNA較短或者與片段化形成的分子機制有關,也未曾深入探討1。為了解答前述這些問題,香港中文大學盧煜明教授帶領他的研究團隊設計了一連串實驗來進一步探討2。首先,他們將孕婦長(170-250 bp)、短(60-155 bp)游離DNA片段的斷點位置都找出來,並加以比較。結果發現長短片段斷點位置有重疊的部分分別只佔「長組」與「短組」12.5%及18.2%的比例,此顯示孕婦游離DNA的片段化確有斷點位置上的偏好,而這個偏好與片段化的長度有關。在應用上,若將此斷點位置的資訊當作濾網先進行一輪篩選,則能將原本利用游離DNA長短比例進行fetalfraction估計的準確度提高⼀Pearson correlation的R可由0.67增加到0.79,而預測trisomy 21 (T21)的相對準確度亦可提高3個百分點。也就是說,斷點位置資訊的加入,可望提高NIPT檢測的準確度並降低對定序深度的需求。

 

  此外該研究團隊還發現長、短不同的游離DNA片段其斷點位置分別位在linker DNA上、及nucleosome core中,這樣的游離DNA分布不論懷孕與否皆可被觀察到;且從chromosome Y游離DNA的斷點位置和片段長短之間的關係來看,發現不論男女都呈現相似的對應關係。由此可證明游離DNA長短與偏好的斷點位置、以及nucleosome結構緊實程度之間的相互關聯,並不僅只於孕婦血漿中如此,而實是一個廣泛的現象。只不過,從短長片段的偏好斷點位置(size-tagged preferred end sites)來看短長游離DNA的比例(S/L ratio),在孕婦身上明顯高於未懷孕的健康個體 (詳見圖一);原因是胎盤DNA纏繞的nucleosome core結構較鬆散,DNA分解較易在其中進行,短片段DNA的比例因而增加(詳見圖二),推估這可能跟胎兒DNA甲基化程度較低有關(甲基化程度越高,DNA纏繞便越緊實)。

 

  從這個研究結果,我們知道游離DNA的斷點位置與nucleosome core的結構具高度的相關性。如果將游離DNA斷點資訊與DNA片段長度的資訊相結合,便可提高次世代定序於NIPT檢測應用上的效率。不僅如此,此結果也進一步解答了游離DNA的成因、以及胎兒游離DNA長度為何較一般游離DNA來的更短的疑問。

 

 

圖一、由孕婦與未懷孕健康個體的血漿游離DNA短長片段偏好斷點位置,比較其短長游離DNA比例的分布

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從血漿中游離DNA定序後讀到的短長片段偏好的斷點位置(size-tagged preferred end sites)來比較短長游離DNA的比例(S/L ratio),結果發現此比例孕婦 (pregnant cases)明顯高於未懷孕的健康個體 (healthy subjects)。(圖片來源:Sun, K., et al., PNAS. 2018 May;115(22):E5106-E5114)

 

 

圖二、以ATAC-seq技術模擬DNA易被切斷的位置並統計DNA片段的長度分布

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以ATAC-seq技術3將Sequencing adapter(定序接合子; 含有特定序列可供PCR及定序之用)以Transposase enzyme(轉位酶)轉置入DNA較鬆散處,再以PCR放大定序接合子間的區域,最後以高通量定序統計出被定序DNA片段的長度分佈狀況。此方法能定位出DNA結構較鬆散的區域,這些地方即是較易被切斷的位置,而由被定序DNA片段的長度分佈即可模擬實際情況下被切斷的游離DNA片段長度分布。圖A是來自孕婦白膜層(buffy coat)的DNA(代表來自體組織的nucleosome )長度分布的模擬統計,容易被切斷的位置以剪刀符號標示。如圖所示,易被切出的DNA片段主要有I、II及III三種長度。由於體組織nucleosome core結構緊實,只有nucleosome core外的linker位置易被切斷。圖B為來自胎盤組織的DNA(代表來自胎盤的nucleosome )長度分布模擬統計,易被切出的DNA片段主要有I及IV 兩種長度。IV來自連續的長度區間,其片段的形成和胎盤DNA纏繞的nucleosome core結構較鬆散有關。(圖片來源:Sun, K., et al., PNAS. 2018 May;115(22):E5106-E5114)

 

 

參考文獻

1. Chan, K.A. et al. (2016 Dec) Second generation noninvasive fetal genome analysis reveals de novo mutations, single-base parental inheritance, and preferred DNA ends. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 113(50):E8159-E8168. http://doi.org/10.1073/pnas.1615800113

2. Sun, K. et al. (2018 May) Size-tagged preferred ends in maternal plasma DNA shed light on the production mechanism and show utility in noninvasive prenatal testing. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 115(22):E5106-E5114. http://doi.org/10.1073/pnas.1804134115

3. Buenrostro, J.D., et al. (2013 Dec) Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position. Nat. Meth. 10(12):1213-1218. http://doi.org/10.1038/nmeth.2688

 

 

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