作者:黃勤方/有勁生物科技

 

  不同個體之間基因表現的「表觀遺傳(epigenetics)」差異,可能會受到DNA甲基化的程度所影響;甲基化區域若是看得出個體差異性,就是所謂的DMRs (differentially methylated regions;具差異性的甲基化區域)。事實上,胎兒基因序列中有些特定區域就有甲基化的情形;若這些甲基化區域證實的確帶有表現胎兒特異性的DMRs,便可作為生物標記,拿來鑑別孕期母體血漿檢體中游離DNA(cell free DNA; cfDNA)的來源,區分哪些來自母親、哪些來自胎兒,並應用在胎兒染色體的非整倍體篩檢上。

 

  為了找出上述屬於胎兒的DMRs以作為生物標記,Philippos C. Patsalis研究團隊在2009年所發表的研究1中,利用甲基化DNA免疫沉澱法(Methylated DNA Immunoprecipitation; MeDIP),先將孕期母體周邊血液與胎盤的DNA進行前置處理(詳見文後備註),再用染色體晶片分析(CGH array)針對13號、18號、21號染色體及性染色體上超過2000個DMRs進行鑑定。隨後透過次世代定序對母體周邊血液與胎盤的DNA樣品進行全基因組分析,最後找到了331個有胎兒特異性表現的DMRs。

 

  為了瞭解這331個具胎兒特異性的DMRs在不同胎兒個體間是否有甲基化程度上的差異,該研究團隊將29個胎兒絨毛膜檢體(Chorionic Villus Samples; CVS)和27個未孕女性的血漿樣品透過甲基化DNA免疫沉澱與溶液形式的靶向富集(in-solution targeted enrichment)方法進行分析,並以Illumina NGS定序平台進行評估。甲基化分析結果顯示,胎兒絨毛膜檢體那331個DMRs中有313個的甲基化程度顯著高於未孕女性血漿檢體(來自未孕婦女=非來自胎兒)的DMRs。為了將胎兒與未孕女性的DRMs做更好的區分,研究團隊使用Tukey's HSD method統計方法進行調整,將閾值p定於0.05;結果313個DMRs中有78個通過閾值,且來自絨毛膜檢體的DMRs其甲基化富集的結果和來自未孕女性血漿檢體的DMRs比起來,平均高出2.6倍。

 

  接著,該研究團隊模擬懷孕母血DNA,將染色體套數正常、以及21號染色體為三倍體(T21)的男胎絨毛膜檢體DNA,分別依5%、10%與20%濃度比例分批混入未孕女性血漿檢體DNA,並按照前述研究方法處理樣品及進行定序。定序結果經NIPT分析、使用LOESS model校正G-C鹼基量、並進行Z檢定之後,確定可以從模擬懷孕母血DNA中區分出未孕女性與胎兒的DNA,同時也能正確判別染色體套數正常的胎兒與T21男胎,而T21男胎檢體的Z值也會隨著T21含量濃度比例的升高而增加。此外,研究團隊還實際採集44位懷有11到14週單胞胎的孕婦血漿檢體DNA,進行上述檢驗模式的測試。定序結果顯示胎兒中的38位為染色體套數正常的整倍體、1位T13、1位T18、與4位T21;其中非整倍體的篩檢結果,又再經過染色體核型分析(karyotyping)確認,結果一致。

 

該研究團隊的實驗方法與結果,除了證實胎兒和母體在這331個DMRs上的甲基化程度有明顯差異外,還應用了NIPT來分析篩檢胎兒整倍體與非整倍體的狀況。然而,若欲進一步臨床應用,則需更大規模的樣品數去進行驗證,並且仍需評估此檢測方法的特異性與靈敏度。

 

【備註】甲基化DNA免疫沉澱法 (Methylated DNA Immunoprecipitation; MeDIP)先使用超音波將DNA隨機片段化,之後再用特異性抗體去對5-甲基胞苷(5mC)做免疫沉澱進行辨認,然後以PCR或高通量定序(如microarray、NGS)進行分析。有勁部落格有關MeDIP技術的參考文章如下:

i. 比較MeDIP和MBD對全基因體DNA上CpG序列甲基化程度分析與誤差原因

ii. NGS的DNA Methylation研究利器:MeDIP-BS技術

 

 

參考文獻

1. Keravnou, A., et al. (2018, Jun 11). MeDIP combined with in-solution targeted enrichment followed by NGS: Inter-individual methylation variability of fetal-specific biomarkers and their implementation in a proof of concept study for NIPT. PLoS ONE 13(6): e0199010-e0199012. http://doi.org/10.1371/journal.pone.0199010

 

 

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