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作者：陳正鑫／有勁生物科技

　　非侵入性產前檢查(Non-invasive prenatal testing; NIPT)，此項技術自2008年初次報導至今¹，已多次被證實能提供高度準確的胎兒染色體非整倍體(Foetal chromosomal aneuploidies)偵測結果；如今各國已有許多產檢院所提供此項服務給懷孕婦女作為產檢選項。但對於提供檢測服務的實驗室而言，隨著產檢樣品的與日俱增，檢體的保存方式及其後續影響也成了不得不謹慎面對的重要課題。

　　多數實驗室在檢測過一次NIPT後，會將剩下的血清檢體置於-80℃環境中保存，以備再次測試時所用，然而此種方式是否真的恰當其實無人知曉。近期Scientific reports有篇描述冷凍環境如何對NIPT檢測結果造成影響²的報導，很值得參考。該報導對樣品冷凍前後進行相同NIPT流程後的分析結果做了比較。在第21號染色體的分析數值上，大部分新鮮時確診為三倍體的樣品，其z-score在冷凍之後顯著下降(詳見下圖一a和b)；但是，正常樣品以及第13和18號染色體確診為三倍體的樣品，其所對應到的z-score在冷凍前後並沒有明顯差異(詳見下圖一c到e)。

圖一、樣品冷凍前後的NIPT分析結果比較

圖片來源：Xie, X. et al. Sci Rep. 2019 May; 9(1):6962-6967.

　　如果去比較冷凍前後的樣品定序資料，可以發現新鮮樣品有較高的Uniq-reads/Total-reads ratio(可在「人類基因體圖譜上比對到的定序讀數」相對於「樣品的總定序讀數」的比例)，表示新鮮樣品能提供較多可在後續分析時使用的定序資料(圖二a)。相反地，冷凍後的樣品其GC content值較高(圖二b)，由於GC content值會影響定序品質，值若過高，便會被判定為定序失敗。此外，為了確定冷凍是否會影響血清樣品中胎兒游離DNA的存留比例，該團隊挑出已知確診異常的男胎樣品，並藉由偵測染色體Y來計算冷凍前後的胎兒游離DNA濃度，證實冷凍之後樣品中胎兒游離DNA的存留比例的確有減少的趨勢(圖二c)。

圖二、樣品冷凍前後的定序分析比較

圖片來源：Xie, X. et al. Sci Rep. 2019 May; 9(1):6962-6967.

　　綜合以上，血清檢體冷凍後，胎兒游離DNA存留比例以及有效定序讀數都會減少，導致NIPT對第21號染色體三倍體的偵測數值下降，影響準確性；此外，樣品冷凍後GC content值增加也會提高定序失敗的機率。同樣的情況在偵測其他染色體時是否也會發生，尚須觀察統計更多樣本後才能確定。

　　本文提醒我們，使用冷凍過的檢體樣品進行NIPT檢測時，應考慮冷凍對胎兒游離DNA可能造成的影響；尤其是處理位於分析邊緣值的結果時更需格外小心，以免出現偽陽性或偽陰性的錯誤結果，導致NIPT檢測的失敗。

參考文獻

1. Chiu, R.W.K. et al. Noninvasive prenatal diagnosis of fetal chromosomal aneuploidy by massively parallel genomic sequencing of DNA in maternal plasma. Proc Natl Acad Sci USA. 2008 Dec; 105(51):20458-20463. https://doi.org/10.1073/pnas.0810641105

2. Xie, X. et al. The Effect of Freezing on Noninvasive Prenatal Testing. Sci Rep. 2019 May; 9(1):6962-6967. https://doi.org/10.1038/s41598-019-42980-7