NGS是目前最新且高通量的定序方法,所謂的NGS是指傳統定序法的改良版,而傳統定序法可以分成兩種來說明之。

 

第一種:Chemical Sequencing

 

第二種:Sanger Sequencing

 

 

 

我們就拿Sanger Sequencing來解釋何謂傳統定序法

 

Sanger1977年研究出鏈終止定序法(chain termintin),這是當時簡單又方便的定序法,同時也是奠定了現今NGS的基礎。此方法為:

 

(1)利用DNA當模板,分別將DNA分成4組同時加入DNA polymerase以及dNTP合成。

 

(2)分加入雙去氧核苷酸(ddATPddGTPddTTPddNTP)反應,雙去氧核苷酸           

 

  將會移除烴基,而於合成過程中隨機終止聚合反應,造成不同大小的DNA 

 

  段。

(3)透過電泳分析讀出待測物DNA序列。

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由於有以上的定序基礎,在80年代後出現了自動定序儀器

 

 

 

 

自動定序儀器在目前市面上可見到有IlluminaSolexaABISOLiD

 

Roche454,這些皆可稱為次世代定序儀(Next Generation Sequencing , NGS)

 

然而這三種代定序儀的原理都有些許不同,但不管是哪種都是採用鏈終止定序法(chain termintin)來進行DNA定序,不需要經由細菌進行質體複製,以減少錯誤發生率。

 

次世代定序儀(Next Generation Sequencing , NGS)是種最新的定序技術及概念,

 

藉由大量而快速來進行短序列片段(Short Reads)的定序。其原理(Illumina System)

 

(A)將待測DNA打斷成300-500bp片段,並於兩端接上adapter

 

(B)  將以接上adapter的片段,loding到表面帶有互補adapter序列的晶片(flow cell)上。

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*資料來源:Mardis ER. Next-generation DNA sequencing methods. Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 2008;9:387-402.

(C)透過橋式聚合酶鏈鎖反應進行增幅

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*資料來源:Mardis ER. Next-generation DNA sequencing methods. Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 2008;9:387-402.

(D)loding不同鹼基且標記特定可移除螢光分子的dNTP與反應試劑,重覆進行螢光標記移除與偵測,以達到快速且大量的定序結果。

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*資料來源:Mardis ER. Next-generation DNA sequencing methods. Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 2008;9:387-402.

 

 

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YourGene 發表在 痞客邦 PIXNET 留言(7) 人氣()


留言列表 (7)

發表留言
  • 長老
  • 喔喔!讚喔!
    這篇我居然能讀下去(能稍為理解的意思)耶!
    不過好像有幾句話是重複到嗎?


  • 謝謝你的建議,我們會馬上更正

    YourGene 於 2011/07/27 10:43 回覆

  • 訪客
  • 很清楚的介紹,很感謝:))
  • 訪客
  • SANGER法應該是移除"羥基"吧
  • 不好意思,在選字時沒注意到部首,謝謝您的指正

    YourGene 於 2011/11/04 14:58 回覆

  • NITO
  • 請問我有一隻細菌,以Illumina做全基因定序,基因公司送回的data顯示有10幾個scaffold。請問這代表無法將這些sequence組合成一個完整的circular DNA序列嗎?
  • 是的,若當初序列組裝時的參數沒有太大的錯誤的話,單以這樣的資料是無法組成完整的 circular DNA 序列的。如果再加做 optical mapping 的話,相信有很高的機會能組完整的 circular DNA 序列。

    YourGene 於 2012/01/23 20:54 回覆

  • 訪客
  • 很詳細的介紹! 謝謝. 不過我有個小疑問, 之前自動定序的錯誤應該多半來自Taq 錯誤的neucleotide的incorporation, 而非"細菌進行質體複製"的錯誤, 後者有proof-reading功能應該錯誤率比Taq低很多很多!?
  • 是的,的確來自於Taq錯誤的neucleotide會多於"細菌進行質體複製"的錯誤

    YourGene 於 2012/12/17 11:41 回覆

  • 訪客
  • 很棒的介紹 感謝!!
  • 感謝您的支持;有勁將會繼續努力的在科學研究上面,繼續為大家服務。

    YourGene 於 2016/10/05 10:51 回覆

  • 生科學生
  • 太強了吧