研究生物基因轉錄體的方法有許多種,而使用次代定序儀系統進行轉錄體定序是目前相當熱門的一種方式,科學家們使用 RNA-seq 分析轉錄體表現主要期望能夠獲得三種重要資訊:1. 了解整個轉錄體構造、splicing 位置以及註解基因的功能。2. 將所有轉錄體的表現量多寡定量。3. 找出 alternative splicing 的可能性方式。

   相較於使用轉錄體反應 DNA-RNA 雜合為基礎的 RNA microarray,可以直接地得知轉錄體的方向性,但目前 RNA-seq 所常用的製備方法必須反轉錄成 cDNA,因此缺少了轉錄體序列的方向性,而分析上針對這個問題所作的解決方式為,例如:利用轉譯的蛋白質基因預測 open reading frame、利用 3’端定序量常較 5’端多的 bias、以及藉由真核生物 splicing 位置方向來做判斷。但即使如此,發展能區分出方向性的 RNA-seq 製備方式是很重要的,這是因為當面對較小基因體的物種,如微生物或低等真核生物時,基因會密集的出現在 DNA 的正負股上,而無法確認方向性會造成評估基因表現量上的誤判,另外,當轉錄體表現時,也有機會產生負股調控基因的轉錄體,這些轉錄體並不轉譯,但與蛋白質表現量卻息息相關。

目前被用來製備 strand-specific RNA-seq library 的方式五花八門,容易會讓操作者困惑不知該選用何種方法為佳,因此 2010 9 Levin 等人於 Nature Methods 上發表了一篇文章統整了這些製備方式,筆者使用同一來源的 RNA 作為材料,用不同的製備方式製造 cDNA library,爾後使用 illumina 定序系統獲得序列資料再分析,而評斷這些製備方式孰優孰劣的標準在於:

1. Library complexity-這些 reads 的獨特性高低、

2. Strand specificity- reads mapping 到已知方向性的 transcripts 上觀察方向正

確性

3. Eveness and continuity of coverage at annotated transcripts-觀察 reads 們在基因

上的 coverage 是否夠平均分布、

4. Performance at 5’ and 3’ ends, defined as agreement with known end annotation-

reads mapping 到已知方向性transcripts 上觀察 5’3’ end 的表現。

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a.

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b.


筆者將不同製備方式所呈現出的結果以統計的方式做分析,最後得到的結論為:在 cDNA second strand 合成時導入 dUTP,爾後再於 library 完成後裂解掉帶有 dUTP 的那股以獲得具方向性 library 的方法為最好的方式,統計上在 library complexity 方面 (圖 a),可以看到 dUTP SE 以及 PE 部份都有 42%、84%的高複雜度,甚至與 control 差不多,而在 strand specific 方向正確性方面 ( b-gray bar),包括了 dUTP method共有四種製備方式在此都表現得不錯,大約只有 0.47-0.63%轉錄自負股,與已知的 genes annotation 是吻合的。再來,在序列 Evenness continuity of coverage 方面 ( b-blue bar),使用 dUTP method 佔第二名 (0.76)

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c.

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d.

最後,在 5’3’ end performance ( c),使用 dUTP method 在基因兩端的 reads 數上覆蓋率為 62%與73%。將 dUTP method 製備出的 library control library 做比較後 ( d.) 發現,兩者呈現高度的相關性,也因此根據以上統計後的數值,以及製備流程的方便性,dUTP method 是在製備 strand-specific mRNA library上比較合適的方式。

  

參考文獻:

Levin JZ, Yassour M, Adiconis X, Nusbaum C, Thompson DA, et al. (2010) Comprehensive comparative analysis of strand-specific RNA sequencing methods. Nat Methods 7: 709-715.

 

 


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