之前我們在”跨越定序平台的迷思”一文中提到,同一個library在Illumina的兩個不同定序機台 (Miseq 及 Hiseq2000) 定序的結果並沒有特別的差異。然而,同一樣品在不同 library 製備方法下,會產生出不同的定序結果嗎?

        2012 年 Joern Toedling 的研究團隊以 small RNA sequencing 做了一系列相關的研究,其將老鼠的 ES_XX (embryonic stem cell line female) 及 ES_XY (embryonic stem cell line male) 做為比較的對象,以不同平台的 small RNA library 的製備法處理樣品,並且分析其定序資料,不同製備法配合樣品的資訊如下表。

新圖片 (2)  作者以 pair-wise Spearman rank correlation 分析上表十個樣品間 miRNA reads 數量的 correlation,並且將結果以 heatmap 形式呈現(如下圖)

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同樣品以不同的製備方式及不同的定序平台之 correlation 皆呈現明顯偏低的狀況,例如 ES_XX_454 與 ES_XX_SOLID_v3 相互的 correlation 低於 0.6,除此之外,ES_XX_454 的定序結果也與其他 ES_XX 的定序結果呈現極低的相關性,所以同一樣品用不同平台定序且不同的實驗製備法會使得定序結果大相逕庭。令人感到有趣的是,ES_XX_SOLID_V3 及 ES_XX_SOLID_V4 資料是源自相同的樣品,僅有製備方法略有不同,correlation 便降低至 0.85 到 0.9 之間(如下圖綠色框線),此結果顯現出即使在同一平台定序,small RNA library 的製備方法不同也有可能改變同一樣品定序的結果。另外值得注意的是,ES_XY_Solexa_i_IDT 及 ES_XY_Solexa_ IDT 是源自相同的樣品,採用類似的樣品備製方法 (差別僅在於 ES_XY_Solexa_i_IDT 製備中有加上 barcode,而 ES_XY_Solexa_ IDT 則無),分別來自 Illumina 技術下的 GA IIx 及 Hiseq 2000 兩個不同定序機型,令人驚訝的是這兩個定序結果的correlation 高於 0.95,所以結果顯示不論是用 GA IIx 及 Hiseq 2000 同樣品定序出的結果是非常的相似,並且指出有無添加 barcode 並不會影響定序的結果。然而使用不同的 3’ adapter 製備的 ES_XY_Solexa_Illu,即使與 ES_XY_Solexa_ IDT 用相同的 GAIIx 定序,兩資料的 correlation 較為偏低,此代表 3’ adapter 的種類可能會使得定序結果有所不同,所以作者建議若要比較 Illumina 技術定序出的不同樣品間 miRNA expression,須考量樣品是否皆相同的 3’ adapter 製備 library,而 GAIIx 及 Hiseq2000 或 barcode 的添加有無的差異較不會影響定序結果。

 

 

作者將研究中的十個樣品以miRNA為依據做Hierarchical clustering(如下圖),同一技術平台的定序結果會被歸類為較為相近的群組,而非依照樣品的不同分成ES_XX及ES_XY兩群,除此之外,SOLID群組下,同一版本製備法做出的雄性及雌性ES cell line被判斷成是相近的樣品,反而一樣是雄性ES cell line經由不同製備法定序出來的結果,被辨識成不同的群組。雖然如此,有勁使用的Illumina平台在相同的3’ adapter情況下,即使定序機型不同且有barcode的差異,仍然可以將雄性及雌性的ES cell line分成兩個不同的群組,此顯示出只要使用的3’ adapter相同,分析不同樣品間Illumina技術定序出的small RNA資料,能有高正確性且客觀的結果。

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參考資料:

Toedling J, Servant N, Ciaudo C, Farinelli L, Voinnet O, Heard E, Barillot E.

Deep-sequencing protocols influence the results obtained in small-RNA sequencing.

PLoS One. 2012;7(2):e32724. Epub 2012 Feb 27.

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