NGS 的高輸出量特性,帶給基因體學研究上的突破,然而,目前技術仍有存在一些缺陷,其中最令人詬病的點是定序深度不均勻,造成 NGS 必須提升定序深度,來彌補定序深度不均勻的問題。造成定序深度不均勻的原因很多,其中最明顯的就是序列 AT 或 GC bias 造成,往往 high AT 或 high GC 的區域很難得到滿意的定序品質與定序深度;有一部分的原因很可能是 library 製備過程中造成的,一般 NGS DNA library 製備流程包含,fragmentation、end repair、A-tailing、adaptor ligation、PCR 等步驟,製備流程中,所有的環節都有可能會造成bias,當然包含每一個純化的步驟。為了釐清到底是哪一步驟造成,Aird 團隊利用 QPCR 來檢驗 library 製備流程產生 bias 的情況 (Aird et al. , 2011),結果整理於圖一,縱軸是序列的數量,橫軸是 GC content 的百分比。由圖一可以清楚地觀察到,library 製備的流程中,PCR 過程是造成 bias 的主要原因 (圖一);而 fragmentation、end repair、A-tailing、adaptor ligation 等步驟,不太會產生 high AT 或 high GC 的區域定序深度下降的問題。

圖一

新圖片 

要讓定序深度更加平均,從 PCR 步驟進行改良將是最有效率的。當然製作 PCR free 的 library 一定是最有用的方式,除此之外,還有三種方式來改善 PCR 造成的問題:

(1) 改用不同的 PCR 酵素,表一是 Oyola 團隊,針對 Plasmodium falciparum 這種 high AT genome 進行定序分析後,整理各種 PCR 方式對於定序深度的影響 (Oyola et al. , 2012),值得注意的是,KAPA HiFi 有不錯的效果,是最接近 PCR free 的結果,其次是利用 T7 polymerase 進行 linear amplification 的方式 (這個方式很特別,我會找機會再 po 文說明)。

表一

新圖片 (1)  

(2) 額外試劑的添加,例如: DMSO 與 Betain 等,對於 high GC 的區域皆有提升的幫助,圖二顯示原本無法順利進行 PCR 的序列,再添加了 DMSO 或是 Betain 後,即有 PCR 產物產生

圖二

新圖片 (2)  

(3) 改變 PCR program 的溫度條件,Aird 團隊發現降低 PCR 的升降溫速度並延長 denature 的時間,將有效改善 high GC 序列不易被定序到的問題 (Aird et al. , 2011)。

然而,目前沒有一種 PCR 的方式,可以同時兼顧 GC rich 與 AT rich 的區域,針對不同物種 genome,在製作 library 時 PCR 的條件,都需要去做一些修正,來獲得最佳的定序結果,甚至,應該用不同的條件進行 PCR,以獲得最完整的序列資訊。當然,做 PCR free library 一定是最好的選擇。

 


logo_121_55.png  

 


 

創作者介紹

有勁的生技資訊

YourGene 發表在 痞客邦 PIXNET 留言(0) 人氣()