有勁的基因資訊

NGS 的高輸出量特性，帶給基因體學研究上的突破，然而，目前技術仍有存在一些缺陷，其中最令人詬病的點是定序深度不均勻，造成 NGS 必須提升定序深度，來彌補定序深度不均勻的問題。造成定序深度不均勻的原因很多，其中最明顯的就是序列 AT 或 GC bias 造成，往往 high AT 或 high GC 的區域很難得到滿意的定序品質與定序深度；有一部分的原因很可能是 library 製備過程中造成的，一般 NGS DNA library 製備流程包含，fragmentation、end repair、A-tailing、adaptor ligation、PCR 等步驟，製備流程中，所有的環節都有可能會造成bias，當然包含每一個純化的步驟。為了釐清到底是哪一步驟造成，Aird 團隊利用 QPCR 來檢驗 library 製備流程產生 bias 的情況 (Aird et al. , 2011)，結果整理於圖一，縱軸是序列的數量，橫軸是 GC content 的百分比。由圖一可以清楚地觀察到，library 製備的流程中，PCR 過程是造成 bias 的主要原因 (圖一)；而 fragmentation、end repair、A-tailing、adaptor ligation 等步驟，不太會產生 high AT 或 high GC 的區域定序深度下降的問題。

圖一

要讓定序深度更加平均，從 PCR 步驟進行改良將是最有效率的。當然製作 PCR free 的 library 一定是最有用的方式，除此之外，還有三種方式來改善 PCR 造成的問題:

(1) 改用不同的 PCR 酵素，表一是 Oyola 團隊，針對 Plasmodium falciparum 這種 high AT genome 進行定序分析後，整理各種 PCR 方式對於定序深度的影響 (Oyola et al. , 2012)，值得注意的是，KAPA HiFi 有不錯的效果，是最接近 PCR free 的結果，其次是利用 T7 polymerase 進行 linear amplification 的方式 (這個方式很特別，我會找機會再 po 文說明)。

表一

(2) 額外試劑的添加，例如: DMSO 與 Betain 等，對於 high GC 的區域皆有提升的幫助，圖二顯示原本無法順利進行 PCR 的序列，再添加了 DMSO 或是 Betain 後，即有 PCR 產物產生

圖二

(3) 改變 PCR program 的溫度條件，Aird 團隊發現降低 PCR 的升降溫速度並延長 denature 的時間，將有效改善 high GC 序列不易被定序到的問題 (Aird et al. , 2011)。

然而，目前沒有一種 PCR 的方式，可以同時兼顧 GC rich 與 AT rich 的區域，針對不同物種 genome，在製作 library 時 PCR 的條件，都需要去做一些修正，來獲得最佳的定序結果，甚至，應該用不同的條件進行 PCR，以獲得最完整的序列資訊。當然，做 PCR free library 一定是最好的選擇。