科學家們發現在不同環境發現的古生物化石 DNA,其受損降解的情形其實是很類似的,使用次代定序的平臺研究古代 DNA 能夠直接的檢測許多現象,為人熟知的例如:嘌呤丟失作用 (Depurination)、胞嘧啶的去胺基作用(Cytosine deamiation)fragmentation rate……等等。

   圖一是研究人員將始祖馬的次代定序所獲得的讀序,比對回現代馬基因體後所做的統計分析結果,觀察發現古生物 DNA 時常斷裂在嘌呤 (GuanineAdenosine) 的後方 (Y 軸標示 -1 位置),也因此讀序的第一個鹼基 (Y 軸標示 +1 位置) 有較高的機率出現嘧啶 (CytosineThymine ),這一項證據似乎可以證明嘌呤丟失作用 (Depurination) 對於 DNA 斷裂降解的影響。

圖一

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除此之外,仔細觀察尚可發現到 -1 位置 G 出現的 frequency A 來的稍高,根據作者解釋,這可能與 GA 鹼基的結構式不同有關係,G 在分子結構上具有 Ketone 的分子,因此陰電性較高,容易出現共振的結構而使其較不穩定,當水分子同時攻擊 G A 時,G 會偏向更容易接受水分子的電子而造成鹼基的斷裂,筆者認為這是造成 GA 脫去鹼基並且斷裂的機率不同的原因。

   除了嘌呤丟失作用, DNA 在長時間暴露在環境中降解時,胞嘧啶 (Cytosine) 很容易會被轉換成另一種分子,而造成定序時出現結果誤植的情況,這種現象稱為胞嘧啶的去胺基作用 (Cytosine deamiation)(圖二)

圖二

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胞嘧啶在去除掉鹼基上的胺基之後,會轉變成為胸腺嘧啶 (Thymine) 的同源分子脲嘧啶 (Uracil),因此似乎就可以解釋為何同樣在讀序的第一個鹼基 (+1 位置),出現 T 的機率遠高過 C 的原因 (圖一)。而胞嘧啶的去胺基作用並不是隨機的發生在斷裂的 DNA 分子中的胞嘧啶上,由於 DNA 端點位置更加容易與水分子反應,而 DNA 中段位置的 C可能因二級結構等影響而不易起反應,所以胞嘧啶的去胺基作用,最容易發生在 DNA 斷裂形成單股結構的端點,約 30-50 nt 的位置。除此之外,當人為使用 DNA 聚合酶增幅這些古生物 DNA後,會產生大量的 GCAT 錯誤,因此為了避免這樣的影響,筆者建議最好定序量要盡量提高,以找出真正正確的鹼基,或是在製備 library 之前使用能夠讓被去胺基化的鹼基斷裂的酵素處理,才可以提高古生物定序的正確性。

   DNA 分子不僅會被水分子影響,也有可能跟其他化學物質反應或是自己受到損害後出現不正常的結構,例如:interstrand crosslink,這些影響都會使得 DNA 聚合酶無法正常作用,因此定序上的 bias 會增加,library coverage 會非常不平均,為了避免這些問題影響定序,在製備 library 時必須要使用與一般 DNA 樣品不一樣的方法,或是考慮使用第三代的定序系統,不過目前系統尚不夠穩定,在定序時 error rate 偏高 (5-15),因此期待在日後技術開發進步下,能夠有更多適合的方式來研究古生物的基因序列。

 

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