strand-specific v.s. non strand-specific RNA-seq @ 有勁的基因資訊

RNA-Seq 雖然是這幾年發展的技術，但已經成為分析 transcriptome 的方法，可用來組裝 transcript ，發現 splicing variants 、 single-nucleotide variations 及 fusion genes 等，而 strand specific RNA 更可協助 transcript 組裝及 genome annotation 的正確性。 Lin Wang 等人在 2011 年發表在 PLoS ONE 期刊所發表的研究，提到如何做 strand specific RNA 的 Library construction、與 non-strand specific RNA protocol 比較，及協助證實 gene model 正確性，以下就做個介紹：

Library construction of Strand-Specific RNA-seq
Lin Wang 等人發展的 strand specific RNA-seq 的 Library construction 的方法（如下圖），與 Illumina 原廠所使用的方法差異性不大，只是在第二股 cDNA 合成時，使用 dUTP 取代 dTTP ，並在 Y-shaped Adapter 接上後，利用 uracil-DNA glycosylase （UDG）切除含 dUTP-marked strand。
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Comparison to non strand-specific protocols

為了瞭解 strand-specific (SS) 與 standard non strand-specific (NSS) 的 Library construction 方式是否會影響基因表現的結果，研究者使用 2 周大的水稻幼苗的葉子當樣品，利用 GAII 各跑了 100 million reads , 35nt 的長度，並計算 2 個 Library construction 定序結果的 RPKM 值，兩者間呈現高度的相關（correlation coefficient, r= 0.987），如下圖：

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Analyzing anti-sense alignments

儘管 mRNA de novo 組裝軟體的進步，但研究者提出水稻基因註解模式（annotated gene models）還是有些錯誤。將 Strand Specific RNA-seq 的 reads 進行 genome alignment (SS alignment)，有 2 種 gene model (Os07g36080.1,Os07g36090.1)；而 NSS alignment 的 gene model 只有 1 種 (Os07g36090.3)，因此利用 Strand specific 方法可幫助證實 gene model 及基因表現量上的正確性。

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研究者也透過 Strand specific 方法，發現許多 antisense reads 對到 transcript termini（就像 UTR 區域），這種現象已經發表在一些動物及酵母菌，認為可調控基因的表現，而此水稻研究是植物上的首篇實驗。另外，研究者推測可能是基因的兩端有較少的 thymine（T），造成許多 antisense reads 對上 transcript termini 。

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