DNA 的甲基化現象 (DNA methylation) 是表觀基因體機制 (epigenetic mechanism) 中的一種,其對於真核生物基因調控而言是非常重要,真核生物基因的 5’ 端,常可見到高密度的雙鹼基 C-G 存在,其被稱為 CpG islands,而其中大約有 2-7%的胞嘧啶 (Cytosine),藉著 DNA 甲基轉移酶 (DNA methyltransferase) 作用下被甲基化。另外,在原核生物中,DNA 甲基轉移酶主要的功用是用作保護自己 DNA的手段,以避免遭受內生的限制酶剪切,而利用限制酶對付外來侵略性的 DNA,而在真核生物中,也有藉由 DNA 甲基化來避免 retrovirus 表現的防禦機制被報導過,但無論如何,最主要的功能還是在於調控基因表現為主。

    研究 DNA methylation 現象的實驗方法有許多種,包括重亞硫酸鹽 (bisulfate) 和非重亞硫酸鹽 (non-bisulfite) 的方法,在樣品處理重亞硫酸鹽的部分,胞嘧啶(Cytosine) 會脫去胺基變成尿嘧啶 (Uracil),但是被甲基化的胞嘧啶不會被改變,經 PCR 放大之後定序,比對原有參考物種序列,可以知道哪些胞嘧啶發生了點突變,沒有突變的胞嘧啶,有可能就是被甲基化的候選,在非使用重亞硫酸鹽的方法中,主要是使用對甲基化敏感的限制酵素來當作工具,隨後搭配AFLP (amplified fragment length polymorphism) 技術來做研究。

    2008 年,致力於開發 Optical mapping技術的 Schwartz 團隊,發表一篇利用這項技術來研究DNA 甲基化現象的期刊,他們首先在 E. coli 上做測試,當發現這項結合可行之後,將頭腦動到真核生物中,同樣被熱門研究的人類染色體上。在真核生物上進行 Optical mapping 時,較於原核生物容易出現一個問題

,即是不一定有能製造出足夠切位的限制酶,當電腦分析切位不足的單分子 DNA 影像時,無法轉換成鑑別性高的條帶 (barcode) 資訊,因此會面臨片段重組上的難題。在他們進行人類第九號染色體DNA 甲基化現象研究時,嘗試使用 2 種以上的限制酶來克服上述的問題,一種是在非重亞硫酸鹽研究方法中提到對甲基化敏感的限制酶:EagI (C^GGCCG),另一種是辨識切位完全與前一種不會重疊、對於 CMepG 甲基化不敏感、用來製造條帶資訊的限制酶:SwaI (ATTT^AAAT)SwaI 在人類基因體序列中,按照電腦分析大致上能切碎成平均約 15 kb 的片段,而 EagI 在不考慮甲基化情形下,按照電腦分析大致上能切碎成平均約 32 kb 的片段。如同預期的,EagI 的辨識切位可涵蓋了 78%、大約 27,437 個 CpG islands,而其中大約一半的是獨一切位,將這項預測結果搭配上用來製造條帶的SwaI 實際進行Optical mapping 實驗,電腦記錄分析了實際實驗後的結果 (圖一),並組成了一些 contig 片段,再與電腦模擬片段去做平行比較。

    實驗的結果獲得 21 條可對應上參考序列的 contigs,其中包含了 244 EagI 的切位,酵素的剪切效率大約 85%,下圖一A,黃、黑色橫線由電腦根據 SwaI 切位繪製而成,而由雙限制酶實驗獲得的 contigs 在橫線底下紫色的方塊表示,圖一B-D,節取一段 contigs 詳細描述,B 表示實際顯微鏡下的 DNA 分子切割圖,D 是將 B 電腦分析後的方塊切位圖,C A 圖的放大,比較 C

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圖一.


D後,C 線條上綠色標記表示 EagI 切位,黃色標記表示 SwaI 切位,被甲基化的 EagI 切位無法被 EagI 切動 (藍色圓點),未被甲基化的 EagI 切位可以被 EagI 切動 (紅色圓點)C 線條上方藍色方塊代表基因,綠色方塊代表 CpG islands 位置。圖一E-G,特別標示出一部分包含 DBC1 基因的 contig,使用 Illumina beads array 測得 promoter 位置有一未甲基化的 CpG (G,括弧),而在本次實驗也得到一樣結果 (未甲基化、被 EagI 切開)

    使用 Optical mapping 技術可以有效偵測 DNA 甲基化的位置,可基於單分子層級下作檢測,並且不需要經過化學性的改造核苷酸,此方法使用酵素當作工具,可視為簡單信賴度高的試劑,然而它需要能互相對照的全基因體序列參考,因此這點可能會是日後活用上的限制,

 

參考文獻

Gene E Ananiev, Steve Goldstein1, Rod Runnheim, Dan K Forrest, Shiguo Zhou1, Konstantinos Potamousis, Chris P Churas, Veit Bergendahl, James A Thomson and David C Schwartz. Optical mapping discerns genome wide DNA methylation profiles.  BMC Molecular Biology 9: 68 (2008)




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