次代定序( Next- generation sequencing, NGS ) 的技術自發展以來,應用層面相當之廣泛,舉凡:學術研究、醫學檢測、藥品查驗以及考古起源等,日新月異的定序技術發展之下,使得原本躓礙不前的考古科研有另一層突破性進展,本篇主旨探討利用NGS 巧妙的運籌帷幄,一窺歷史的跡象,揭開對古代生物迷思。古人曾云:「以史為鏡,可以知興替」。古老生物的遺傳密碼在NGS 抽絲剝繭下,間接了解生物演進,這些遠古的遺傳物質aDNA ( ancient DNA ) 經長年累月的歲月摧殘,會產生一些自發性的變異及損壞 ( 如:氧化、水解與 DNA crosslink ),或因外發性的降解 ( 如環境中的微生物所分泌核酸水解酵素,直接崩解 DNA 結構)。形成aDNA 三個主要特性:短片段、嘌呤丟失作用( depurination ) 與去胺基作用( deamination ) (Sawyer et al., 2012),亦在先前之『利用NGS觀察DNA降解現象』一文中,詳細敘述相關的發生過程及原理,但這些現象往往左右定序的正確性,容易造成鹼基配對錯誤 ( misincorporation 或稱 miscoding lesions ) 現象,導致產生錯誤的序列訊息,以下就由三方面的研究作介紹。

壹、遠古動物的研究方面:

    Stiller 等學者在 2006 年的研究,發現猛瑪象的 aDNA 序列,有以下現象:一、異類鹼基置換 ( transversion ):嘧啶與嘌呤間的置換,二、同類鹼基置換(transition):嘌呤之間或嘧啶之間的取代,造成定序的潛在誤配 (圖一),也因為有NGS的大量定序,顛覆研究古代基因組的模式,跳脫以往對於DNA的配對概念。另外,從時間角度來看,aDNA 的變化不易隨時間推移,而增加片段的瑣碎程度,Sawyer等學者觀察從幾十年一直到幾萬年的粒腺體DNA ( mitochondrial DNA, mtDNA ) 片段平均大小,研究發現似乎無太大差異,如紅點所示幾乎都集中分佈在40100 bp的片段範圍(圖二)

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圖一

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圖二

貳、遠古植物的研究方面:

    標本是保存古老歷史的重要媒介與資產,如今並不侷限於展覽之途,更可從中獲得其潛在的寶貴遺傳信息,以及植物演化的痕跡,而且標本製作並無考量該物種的DNA保存問題,製備過程中勢必對 DNA 造成某些程度之損害 (如:高溫乾燥、酒精與福馬林的化學浸泡處理等…),有鑑於此,Staats 等學者在 2011 年利用 NGS 技術,賦予博物館的古老植物標本新生命,開闢對於研究古老植物標本的新思維,了解標本中 DNA 的變化程度,因此,作者比較古老的植物種類,如鵝掌楸 ( Liriodendron tulipifera )、銀杏 ( Ginkgo biloba ) 和金鏈花 ( Laburnum anagyroides ) 之新舊標本與活體組織,其胞器 (葉綠體、粒腺體與細胞核) 之 DNA 總量與其所屬基因的拷貝數(表一),研究結果顯示此兩項的比較,只要被製成標本比起新鮮組織即有明顯差異,但標本間的比較,不會隨保存時間延長而下降;然而,標本間的鹼基卻因年代久遠,產生同類鹼基置換機率亦隨之提升(表二),此misincorporation 現象廣泛存在遠古的植物之間。不過將保存已久的標本重現其序列真實原貌,似乎不再是紙上談兵,利用 NGS 也賦予館藏或稀有滅絕植物種類的新生命。

 

表一、Mean DNA yield, mean gene copy numbers, and DNA yield loss-corrected copy numbers for plastid, mitochondrial and nuclear DNA relative to fresh control.

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表二、Estimated (CT/GA) rate in herbarium plastid DNA during herbarium storage.

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叁、遠古人類的研究方面:

    人類起源?幾千年來,學者不斷探索此問題,熱門電影普羅米修斯中所圍繞的主軸,係架構於探尋人類的起源,所展開地外尋根之旅這個跨世代課題亦是考古界欲追求的極致巔峰。然而,相關人類考古之化石遺物不完整,欲拼湊出完美答案著實不易。如此跨時代的追本溯源,現今或許可藉 NGS 技術,跨越這條時代鴻溝。以往研究遠古人類 ( 如:尼安達塔人等… ) 的遺傳密碼,通常藉骨骸化石中抽絲剝繭出片段的粒線體 DNA,進一步與現代人類的親緣關係做比較,但卻無法一窺基因組之完整面貌,直至 2012 年在 Nature Communications 雜誌上,發表一篇關於 5300 年前冰人奧茨(Tyrolean Iceman)的全基因組定序與起源,有別於以往,本篇材料直接採用保存完善的木乃伊進行實驗,此種無價的文化遺產,更可提供我們了解遠古時空背景的相關資訊,Keller 等學者在其定序的結果同樣也發現一些 aDNA 變化模式,似乎片段斷裂的端點處為嘌呤類之頻率有增加趨勢 (圖三A),進一步將每條序列 ( read ) 比對至人類基因組 hg18 資料庫,結果顯示會有同類鹼基置換的現象,進而造成定序誤配 (圖三B),親緣比對也發現可能與歐洲的科西嘉島 (Corsica) 及薩丁尼亞島 (Sardinia) 上的居民親緣關係較近。至目前為止,綜觀三者研究,藉由NGS 的技術穿梭古今中外,微觀aDNA 可能變異的規則,進而規避對序列的誤判,但由於隨時間的推移累積,亦或遭受環境的嚴苛考驗,尚有許多未知變因,等待去發現與研究,而NGS 技術將繼續賦與許多科學研究上的價值。

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 圖三、Analysis of DNA damage patterns.

      (a) Average nucleotide composition around the ends of the analysed reads.

      (b) Observed rate of C to T and G to A transitions.


參考文獻:

1. Stiller, M., Green, R. E., Ronan, M., Simons, J. F., Du, L., He, W., Egholm, M., Rothberg, J. M., Keates, S. G., Ovodov, N.D., Antipina, E.E., Baryshnikov, G.F., Kuzmin, Y.V., Vasilevski, A.A., Wuenschell, G.E., Termini, J., Hofreiter, M., Jaenicke-Despre´s, V. and Pääbo, S. (2006) Patterns of nucleotide misincorporations during enzymatic amplification and direct large-scale sequencing of ancient DNA. PNAS. 10313578–13584.

2. Staats, M., Cuenca, A., Richardson, J.E., Vrielink-van Ginkel, R., Petersen, G., Seberg, O. and Bakker, F.T. (2011) DNA damage in plant herbarium tissue. PLoS ONE. 6(12)e28448.

3. Sawyer, S., Krause, J., Guschanski, K., Savolainen, V. and Pääbo, S. (2012) Temporal patterns of nucleotide misincorporations and DNA fragmentation in ancient DNA. PLoS ONE. 7(3)e34131.

4. Keller, A., Graefen, A., Ball, M., Matzas, M., Boisguerin, V., Maixner, F., Leidinger, P., Backes, C., Khairat, R., Forster, M., Stade, B., Franke, A., Mayer, J., Spangler, J., McLaughlin, S., Shah, M., Lee, C., Harkins, T., Sartori, A., Moreno-Estrada, A., Henn, B., Sikora, M., Semino, O., Chiaroni, J., Rootsi, S., Myres, M., Cabrera, V., Underhill, P., Bustamante, C., Vigl, E., Samadelli, M., Cipollini, G., Haas, J., Katus, H., O’Connor, B., Carlson, M., Meder, B., Blin, N., Meese, E., Pusch, C. and Zink, A. (2012) New insights into the Tyrolean Iceman’s origin and phenotype as inferred by whole-genome sequencing. nature communications. 3(698)1-9.



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