真核生物的genome size較原核生物大,且有許多條大小不一的染色體,所以在進行optical mapping及定序資料的組裝上較為困難。若能將真核生物的每個染色體獨立的分離出來,再分別進行定序或解出restriction enzyme map,對序列組裝上會有相當大的幫助。

將不同大小型態的染色體分離出來的技術一直以來都有許多研究團隊在開發,其中的技術包含使用micromanipulator配合雷射切割、使用原子力顯微鏡atomic force microscope nanolithography及流式細胞儀Flow cytometry,其中流式細胞儀Flow cytometry是被認為分離效果較佳的技術。

        Flow cytometry是生物學上相當常用的技術之一,例如當一個樣品中混有許多不同特性的細胞在裡面時,Flow cytometry可以依據細胞的顆粒性及螢光染色呈色性,將相同性質的細胞做分群分析且可將同一性質的細胞分別分離出來。不同染色體之間的大小及DNA螢光染劑染色後的螢光相對強度亦不相同,所以可以利用Flow cytometry將染色體獨立的分開來(如下圖)。

20121102_pic1  

        

以人類為例,取metaphase時期的細胞染色體,同時使用DNA專一性染劑Hoechst 33258及chromomycin A染色,不同染色體的分群狀況如下圖,第九對到第十二對染色體及第十四與第十五對染色體型態過於接近,較難分離,但其他對的染色體都能成功的被分離出來。

20121102_pic2  

 

在植物上,也有許多研究團隊嘗試以Flow cytometry分離不同的染色體,能成功分離出來的染色體依照不同物種數量不一(如下表)。

20121102_pic3  

 

由於染色體大小遠小於細胞,所以當Flow cytometry再分離染色體的解析度必須要比分離細胞更高,如此才能再提升分離的效果,除此之外,溶液中若純化染色體不乾淨而留下的小細胞碎片或細菌顆粒也可能會影響到分離的結果。雖然目前在技術上能有許多待突破的地方,以Flow cytometry仍無法完全將不同染色體分離出來,但若增進分離的解析度後,對於基因體學上定能有相當大的助益。

 

 

Reference:

Doležel J et al. Chromosomes in the flow to simplify genome analysis . Funct Integr Genomics. 2012 Aug;12(3):397-416. doi: 10.1007/s10142-012-0293-0. Epub 2012 Aug 16.

 

 

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留言列表 (1)

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  • Chih Wei Huang
  • 請問有可能應用於分離粒線體或葉綠體嗎?
  • Hi Chih Wei Huang
    日前有研究團隊針對從植物細胞純化出的chloroplasts,經由SYTO 42染色後,以Flow cytometry將這些chloroplasts依據螢光的強弱,sort各種不同DNA content的chloroplasts。在Flow cytometry上,也已經有發展出可以sort直徑最小0.3 um的organells,chloroplast及mitochondria在sort大小解析度上不會有太大的問題,所以,應用於分離不同特性chloroplast或mitochondria理論上是可行的。然而,若要利用Flow cytometry直接從植物細胞分離出chloroplast及mitochondria,早期1990年代確實有科學家研究其可能性,但發現在技術上是相當困難,因為樣品中混有的organells種類相對複雜許多,結果分離的效率相當差。以下兩個網頁資料供您參考,謝謝您的發問。

    http://www.plantmethods.com/content/3/1/5 
    http://www.horizonpress.com/cimb/v/v3/v3n204.pdf

    YourGene 於 2012/12/12 09:09 回覆

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