有勁的基因資訊

       想知道某些環境因子的改變（如：生病的腸子或加了料的海水）會使環境中的某群生物（如：細菌或浮游生物）在群聚結構或基因表現有何反應嗎？2012年2月的PNAS剛好就有篇paper利用metatranscriptome分析Fe2+離子缺乏的海水加料(阿就是Fe2+離子)後，其藻相與基因表現是如何反應的[1]。

 圖1. 紅色與綠色區域為HNLC，位置分別在南大洋、太平洋赤道區域、北太平洋副極區 (http://www.geos.ed.ac.uk/homes/s0675905/MScBSc.html)

故事是這樣的，在地球海水表層有一些區域氮含量很高，有趣的是這些區域的藻類生產力並沒有因為氮的增加而提昇，相反的，這些區域的葉綠素濃度還比較低，是曰 high-nitrate low-chlorophyll (HNLC) regions（圖1）。神奇的是，當NHLC海水被添加Fe2+離子後，藻相由原本佔據大部分生物量的藍綠藻 (cyanobacteria)、綠藻 (chlorophytes) 與鞭毛藻 (haptophytes)等小型快速生長的浮游藻類，轉變成由矽藻為主的群聚。作者想知道，這事件發生的前後，整個真核浮游生物的群聚在生理上有什麼樣的改變，所以抽了mRNA看看哪些基因的表現量有顯著的改變。

礙於科技的限制，目前 metatranscriptome 實驗在定序的規劃上常將454與Illumina或SOLiD的資料合併分析，454提供較長的序列，並將 Illumina或SOLiD的reads mapping 回前者以增加coverage，而本篇文獻是採用454 GSFLX 與 SOLiD這兩個平台，由454產生平均長度約200 bp；SOLiD產生平均長度50 bp的序列一起進行分析。實驗組與操作組（加Fe2+離子後培養一段時間的海水）的454資料中各有約100,000條、60%左右的read，在e-value ≤10⁻³的條件下tBLASTx 有 hit到 National Center for Biotechnology Information’s EST database 與 National Center for Biotechnology Information’s nonredundant (nr) database這兩個資料庫的資料，進而分析物種組成（圖2）。

圖2. 可以發現，現撈海水(ambient)與加Fe2+離子後培養一段時間的海水(plusFe)，被認定是來自矽藻(Diatoms)的reads數有很大的差異。

此外，他們也做了和植物營養代謝有關的mRNA differencial expression，並使用KEGG將有顯著差異的基因進行代謝路徑分類（圖3）。值得注意的是，未避免不同物種生物量的改變對於基因表現量分析產生的資料偏斜，作者使用 trimmed mean of M values (TMM) normalization method與Microbial Assemblage Normalized Transcript Analysis (MANTA)等方法將資料進行標準化，並在判斷基因是否有表現量差異時增加了一些限制。

圖3. 作者比較環境海水與加Fe2+離子海水樣品的基因表現差異，此圖為被辨識為矽藻的序列，圓餅圖中不同深淺褐色代表不同種矽藻所佔該基因reads數的百分比。圓餅圖外圍為黑色為該基因的表現量有顯著差異，灰色外圍反之。不同顏色的基因名稱代表不同的代謝功能分群，其中綠色為光合作用相關、橘色為固碳作用、藍色為氮同化作用、紫色為金藻昆布多醣合成、紅色為尿素循環、黑色為其他。（除了矽藻外，作者也有拿綠藻、定鞭藻做類似的分析，礙於版面限制，這邊只有放上矽藻的結果，敬請見諒）

然後故事就這麼進行下去...。等等，應該有人跟我一樣好奇，這篇paper所使用的454 read平均長度也才200bp左右，這對現在的illumina的平台並非難事啊。是的，有勇者出現了，2012年4月有篇利用 Illmina平台分析小鼠腸內細菌的metatranscriptome的paper刊在PLOSONE [2]，或許metatranscriptome的實驗需要依附在454平台下已經是過去式。

References:

[1] Marchetti, A., Schruth, D. M., Durkin, C. A., Parker, M. S., Kodner, R. B., Berthiaume, C. T., . . . Armbrust, E. V. (2012). Comparative metatranscriptomics identifies molecular bases for the physiological responses of phytoplankton to varying iron availability. Proceedings of the National Academy of Sciences, 109(6), E317-E325.

[2] Xiong, X., Frank, D. N., Robertson, C. E., Hung, S. S., Markle, J., Canty, A. J., . . . Danska, J. S. (2012). Generation and Analysis of a Mouse Intestinal Metatranscriptome through Illumina Based RNA-Sequencing. PloS one, 7(4), e36009.