過去,是利用培養的方式來探究環境中微生物的組成,然而,百分之99以上的微生物是無法培養的 (Amann et al., 1995),因此,80年代發展出非培養的研究方式(cultured independent method),包含T-RFLP、DGGE、SSCP、以及cloning and sequencing的方式來研究環境微生物的族群 (Nocker et al., 2007),以上方式,皆是針對族群共有的目標基因的amplicons來分析,目標基因是依據不同的觀察目標而有所差異,常用的基因有18SrRNA (Eukaryotic microbes)、ITS (Eukaryotic microbes)、Bacterial 16S rRNA、Archaea 16S rRNA、與一些功能性的基因 (如 psbA、psaB、amoA與amoB)。T-RFLP、DGGE、SSCP、以及cloning and sequencing四種方式中,以cloning and sequencing的方式能夠提供最精確的資訊 (表一),然而,在面對高度複雜的環境生態時,必須挑選許多clone去進行定序,才能足以呈現真實的物種組成,例如,至少需要定序1000個clone才能夠呈現沿岸海水的細菌族群圖譜 (Acinas et al., 2004)。

從2006年開始有研究利用目標基因amplicons (如 bacterial V6),直接進行次代定序,即所謂的Amplicons high throughput sequencing,不但可以免除cloning繁複的流程,而且可以獲得大量的序列資訊 (Sogin et al., 2006),以Illumia定序技術定序平台為例,一次可以得到超過100,000,000條序列,這種方式同時擁有高輸出量以及高精確度的特性,因此能夠精確地呈現高度複雜的微生物族群圖譜 (表一)。這種amplicons的定序還能夠配合multiplexing(註一)的方式,讓兩種以上來源的樣品同時進行定序,使的定序更加有效率 (Binladen et al., 2007)。這樣的實驗方式已經被廣泛利用,包含人類共生菌的研究 (Huse et al., 2008 and Hummelen et al., 2010)、海水菌相研究 (Anderssonet al., 2010)以及土壤環境研究 (Chu et al., 2010)。


表一

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由表一的比較可以得知,利用PCR的方式放大16S rRNA的基因後,搭配NGS來獲得微生物的community,是目前最有效率的方式,然而,這依然不是完美的方法,主要的問題是 PCR後的序列數量,是否有能夠代表微生物的數量?這至少牽涉到三個因素會影響到準確度,

1、Primer的專一性與PCR偏誤問題

圖一是比對多種微生物的16S rRNA gene,整理出來的序列變化,Sequence Entropy代表序列變異的程度,V1、V2、 V3、 V6 與V7表示變異度高的位置,其他區域是相度變異度較低的區域,常用的”Universal primer”就是設計在這些區域;由圖一可以觀察到,即使在變異度較低的區域依然存在變動性,因此,”Universal primer”必然有些偏好,有可能A物種與B物種16S rRNA gene,放大的效率差異太大,再加上PCR本身的偏誤問題(請參考”都是PCR惹的禍”文章),造成後續結果的誤判。

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APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, 2009, p. 3263–3270 

 

2、DNA 萃取效率

不同種類的微生物,其細胞型態也會有所差異,革蘭氏陽性菌與藍綠菌會有相對較厚的細胞壁,造成DNA萃取效率下降,進而造成低估菌的數量。

3、16S rRNA基因數目不同

不同種類的微生物16S rRNA基因數目也不盡相同,即使是同一phylum下,16S rRNA gene copy number也不同,例如Proteobacteria的16S rRNA gene就有2個copy到15個copy不等。因此,即使在PCR完全沒有任何偏誤且DNA萃取的效率皆相同的情況,仍然會有問題存在。

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 APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, June 2010, p. 3886–3897

以上三點問題,無論是在T-RFLP、DGGE、SSCP、或是cloning and sequencing,都是存在的,即使搭配NGS的技術都無法突破的瓶頸,尚待未來科技的進展來突破。




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