在哺乳動物,DNA 甲基化通常發生在CpG dinucleotides 上,而且是研究基因調控和疾病誘發重要的epigenetic mark 。詳細的了解 DNA 甲基化程度和位置對於研究發育 (development) 和疾病型態 (disease phenotype) 有很大的幫助,尤其以癌症來說,甲基化的研究可以提供診斷的 biomarker。在哺乳動物的DNA大約有~1 % 的 5’-methylcytosine (5MeC), 其中這甲基化有70~80% 位於CpG dinucleotides。但是DNA methylation pattern 在每一個個體或是組織會有所不同,是處於一種動態的模式,這樣的情況讓基因的定序常常有偏差的情況發生。

  近年發展了三種研究 DNA 甲基化的主要方法:

1. Chemical conversion with sodium bisulfite

2. Digestion with methylation-sensitive restriction enzymes

  • 3. Affinity enrichment of methylated DNA

 

這三種方法都可以應用到microarray hybridization techniques 和 next generation sequencing technology。此篇文章主要討論的是第三種的Affinity enrichment of methylated DNA。而進行Affinity enrichment of methylated DNA又有分兩種方式:

A.  methyl-DNA immunoprecipitation (MeDIP)

B.  methyl-CpG binding domain-based (MBDCap) protein

第一種是methyl-DNA immunoprecipitation (MeDIP),主要藉由monoclonal antibody 去與單股 DNA 上的 5MeC做專一性結合。第二種方法是利用methyl-CpG binding domain-based (MBDCap) protein 可以對片段化的雙股 DNA 上的甲基化區域做親和性的結合,又以 step-wise elution series ( 0.2M-2 M NaCl) 或是single fraction elute 等不同的的方式elution。本篇作者想得知鹽離子濃度上的差異,對於最後分析出來的 DNA 甲基化的程度是否有結果上的不同。

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本篇作者以正常的前列腺細胞 (prostate normal cell; PrEC) 和 前列腺癌細胞(prostate cancer cell; LNCaP)來測試 MeDIP, MBD-SF (single fraction elution; 2M NaCl) 和MBD-Elu5 ( 1 M NaCl eluted) 有何結果上的差異。主要分析位置是 chromosome 7,因為 chromosome 7 上沒有copy number variations (CNV), 可以避免CNV 對DNA 甲基化產生分析上的影響。

 

綜合MeDIP, MBD-SF和MBD-Elu5的產物配合Affymetrix Human Promoter 1.0R array 去偵測 differentially methylation regions (DMRs), 比較PrEC和LNCaP這兩種細胞,可以得到在 chromosome 7上的1030 promoter 有 342 個區域有不同程度的甲基化現象。其中有198 個在LNCaP上是hypermethylation,其他144 個是hpomethylation。但是若是分別分析DMRs,在這三種方法之下只有26個區域得到相似的分析結果。

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本篇作者再利用 Sequenom MassCLEAVE technique 去確實地將DMR區域的 CpG density 偵測出來。結果發現,以 MeDIP 和 MBD-SF 這兩種方法取得的甲基化DNA,其 CpG density 比較低。而 MBD-Elu5 取得的DNA 其CpG density 較其他兩個方法更高。

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這樣的結果不代表可以捉住高度 DNA 甲基化的MBD-Elu5 對於實驗結果的正確性就相對的高。因為對於疾病的甲基化分析通常位於 promoter 上游的位置,而一般而言,這些位置會因為有transcriptional regulation的作用所以反而CpG density比較低。所以偏好捉住低CpG density DNA 的MeDIP 反而可能是比較準確的方法---雖然它是比較舊的技術。

 

 

 

參考資料:

Nair, S.S., Coolen, M.W., Stirzaker, C., Song, J. Z., Statham,A. L., Strbenac, D., Robinson, M.D.,and Clark, S.J.  Comparison of methyl-DNA immunoprecipitation (MeDIP) and methyl-CpG binding domain (MBD) protein capture for genome-wide DNA methylation analysis reveal CpG sequence coverage bias. Epigenetics (2011) 6:1, 34-44.

 

 

 

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