隨著NGS次代定序的技術不斷的推陳出新，其能力所涵蓋的層面亦越來越豐富，但一套完整的NGS，其構成的條件，不單只有最新的定序儀器就足夠，定序核酸樣品的良劣往往左右最後定序結果，所謂工欲善其事，必先利其器，要怎麼收穫就要先怎麼栽的道理。本篇文章主要淺談游離核酸(Cell-Free nucleic acids) 的品質對於NGS定序之重要性。在醫學方面，以游離核酸的研究漸趨深入，其為一種細胞外呈游離狀態的小片段核酸，存在於血液、尿液與唾液等…，大部分可經由三種方式：細胞凋亡（apoptosis）、細胞壞死（necrosis）與胞泌作用（secretion）進行胞外釋放(圖一)，其中又以游離DNA (Cell-Free DNA，cfDNA) 應用於癌症腫瘤監控及胎兒產前的診斷(圖二)之進展最為豐富。
圖一
圖二
關於產前醫學診斷方面，由於少子化的時代，相對重視每一胎的健康品質，且因應NGS時代來臨，對於產前診斷的技術又更上一層樓。此技術即利用萃取胎兒與母親交換後，飄零於血液中的胎兒DNA，進行只需抽血的低風險且無創性產前胎兒檢測，因懷孕前期，母親血液中之胎兒核酸含量不高，因此，所萃取出的核酸含量與品質的優劣，都會影響製備NGS的Library品質。
圖三
有鑑於此，於 2011年 Barrett的研究團隊，針對從孕婦血漿中分離出的cffDNA（cell-free fetal DNA），進行如何最佳化保存cffDNA的相關探討，欲找出影響cffDNA比例的關鍵，進一步獲得穩定且高比例的cffDNA。因為血液樣品，從抽血至萃取cffDNA之過程中，其內會含一些去氧核糖核酸酵素等…影響物質，進而降解血液中核酸，最終可能影響獲得cffDNA的濃度與品質。Barrett等學者將血液樣品分成不同的處理方式，如：抗凝採血管之材質、保存時間、儲藏溫度，針對以上因素，探討是否對血漿中游離DNA濃度造成影響。實驗設計如下，取樣後在室溫放置不同時間(圖三A)，取樣後在4℃放置不同時間(圖三B)，比較同一時間點的不同溫度(圖三C)，比較同一時間點的不同抗凝採血管(圖三D)，觀察其中cffDNA 的含量。綜合以上實驗得知，即使保存於4℃溫度，血漿內 cffDNA含量確會隨時間降低，尤其放置24小時之後，含量從平均 10％下降2 至 3 個百分點。再者，血液樣品越新鮮越好，若樣品無隨即萃取cffDNA，則建議放置不要超過8小時，並慎選抗凝採血管的材質[其中以cell-stabilizing (S)優於K3EDTA(E) ]，以利進行抽血後之血液保存。因此，唯有高品質的cffDNA，才可能有最佳化的Library品質與定序結果。
NGS次代定序的興起，利用 NGS 喚醒漂泊於血液中的DNA，讓沉默的DNA文字，變成一句句發聲語言。不僅滿足人類探索如叢林般的未知醫學領域研究，更可能激盪出新穎檢測的可能性，為人類的醫療福祉創造無限的願景。
Cell-free nucleic acids as biomarkers in cancer patients. Nature Reviews Cancer. 11：426-437.
2. Dennis, Y.M.L. and Rossa, W.K.C. (2007)Prenatal diagnosis: progress through plasma nucleic acids. Nature Reviews Genetics. 8：71-77.
3.Barrett, A.N., Zimmermann, B.G., Wang, D., Holloway, A., and Chitty, L.S. (2011) Implementing prenatal diagnosis based on cell-free fetal DNA: accurate identification of factors affecting fetal DNA yield. PLoS ONE 6(10): e25202.
留言列表
{{ article.title }}
