RNA病毒是許多重要疾病的致病源,包含AIDS、流感、SARS等造成大眾健康威脅的疾病。常用標準的檢驗方式,仍需要依靠已知的核酸序列或者蛋白質抗原資訊來完成檢驗確認;近年來次世代定序技術發展快速,可應用於新興未知的病毒鑑定,然而真正應用於臨床上仍有其困難點,由臨床樣品抽取得到的核酸量通常很低且品質很差,並且包含大量非感染源的核酸,會造成分析上的困難,無法正確de novo出真正病原的genome。

本篇研究[1]以愛滋病毒(HIV)、西尼羅病毒(West Nile virus)以及呼吸道融合病毒(respiratory syncytial virus)作為樣品測試,在實驗部分使用SPIA(single-primer isothermal linear amplification)的技術放大核酸,在生物資訊分析的部分使用VICUNA組裝程式,將上述三組病毒,原始核酸總量介於femtograms到attograms之間,成功組裝出其完整的”基因序列”;此研究開啟了NGS實際應用於臨床檢驗的大門,對於未來可能發生的新興病毒檢測,有極大的助益。

SPIA技術由Nurith Kurn等人於2005[2]所發展,此技術價值在於可以保留真實核酸組成的profile前提下,放大核酸總量達萬倍以上(picogram total RNA to several microgram cDNAOvation®

 RNA-Seq System V2)。原理如下圖:

20130419_S_pic1  

 

 

原始樣品核酸作反轉錄的時候,使用修飾過random primer以及poly_T primer(在尾端加上一段RNA的序列adapter(SPIA primer))合成first strand cDNA,接著合成second strand cDNA(with SPIA pimer, DNA),而這第二股的cDNA則可以用作template,使用SPIAprimer(RNA)以及RNAse H活性,反覆放大核酸,得到大量的cDNA,由於同時使用hexmer以及poly Tprimer,可平均放大完整的RNA,保留其真實的表現profile,避免3’poly Tfalse positive,之後就可以直接製備NGS library及定序。

 

文章中作者使用了不同濃度的臨床檢體(clinical sample)以及positive control(clone sample)測試,組裝出來結果如下table,可看出結果都很不錯,10HIV的樣品中,有7個樣品將全部9個基因都完整組裝出來,2個樣品有1個基因沒有完整組裝,1個樣品則有2個基因沒有完整組裝,其他病毒測試結果也很接近,透過這樣的實驗流程以及軟體分析,可以組裝出完整度很高的病毒基因,對於臨床檢驗是一個很大的進步。

20130419_S_pic2  

 

 

 

References:

1.         Malboeuf, C.M., et al., Complete viral RNA genome sequencing of ultra-low copy samples by sequence-independent amplification. Nucleic Acids Res, 2012.

2.         Kurn, N., et al., Novel isothermal, linear nucleic acid amplification systems for highly multiplexed applications. Clin Chem, 2005. 51(10): p. 1973-81.

 

 

 

 

Yourgene Bioscience

YourGene 發表在 痞客邦 PIXNET 留言(0) 人氣()