腦脊髓液是直接與人類大腦或神經接觸的體液,所以在研究或臨床診斷神經性病變、中樞神經腫瘤、腦部創傷及腦膜炎等疾病時,皆會進一步探究腦脊髓液的內容物,若其中存有大量特殊蛋白、細菌、異常顏色或細胞,可協助醫師執行後續治療策略,在研究上,亦能輔助判斷疾病的致病機制。

目前已有許多研究利用次世代定序分析血漿內游離的miRNA,其具有潛力做為許多疾病的marker,本部落格在先前文章已有介紹。針對腦脊髓液內游離的miRNA,多數研究是利用qRT-PCR研究,例如在阿茲海默症有被發現miRNA表現情形與正常人不同,但較少利用次世代定序研究腦脊髓液的miRNA,此主因為每個病人一次取得的腦脊髓液有限,這些腦脊髓液含有的total RNA總量極為稀少,而miRNA又以極低量存在這些微量total RNA中,所以導致實驗執行上的困難。

Kasandra Lovette Burgos等科學家為突破此困難,首先,他們先找尋最適合萃取腦脊髓液游離RNA的試劑,其應符合高回收率、無RNA長度的限制及操作方便性,作者先以性質類似的血漿做為測試的樣品,比較各式萃取試劑的回收率,結果如下圖,在200 ul的腦脊髓液內,回收率較佳的試劑組為mirVana、PARIS mirVana、Qiagen miRNeasy及BiooPure,約能萃取到15 ng的total RNA。

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考量到萃取過程中可能會有miRNA的損失,所以在試驗前,這些血漿樣品皆有額外加入等量的人工合成miRNA做為陽性控制品,萃取結束後,再以qRT-PCR分析,確認這些萃取效果較佳的試劑過程中不會有明顯的miRNA損失,(其中Cp數值越低,代表miRNA較多)。

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在測試的過程中,發現如果在phenol-chloroform分離RNA時,重複做兩次,可明顯提升萃取的回收量,如下圖。

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第一次分離完後,其實還有很大量的RNA殘留在分離層的交界,下表分別顯示第一次分離及第二次分離萃取出的RNA量,可發現第二次得到的RNA幾乎與第一次取得的量相同。從下表中亦能發現腦脊髓液CSF萃取出的RNA量較血漿中的少。

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作者最後以0.50.7511.25 ml的腦脊髓液萃取出的RNAtruseq small RNA kit製備library,藉由將製備過程的材料減半,例如adapter減半,可成功製備出library,定序出來排名前50miRNA如下表所示。

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值得一提的是,作者發現同一個人的腦脊髓液,其定序結果(包含miRNA表現量排名)不會因為RNA是萃取自0.50.7511.25 ml腦脊髓液而有所不同,除此之外,同一人的血漿及腦脊髓液之間,雖然miRNA的種類有部分相同,然而表現的情形是幾乎不一樣的(median Spearman correlation across five subjects = 0.6047526).,如下圖所示,並且不同人間的腦脊髓液miRNA定序結果是相似的,血漿中的miRNA也是如此。

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作者的研究使得利用次世代定序技術辨別腦脊髓液游離miRNA不再是難以達成的實驗,可讓更多的科學家再深入研究miRNA在各種腦部或神經疾病扮演的角色及疾病機制探討,或找出疾病特定的marker,甚至可追蹤相關的治療成效。

 

參考文獻:

Identification of extracellular miRNA in human cerebrospinal fluid by next-generation sequencing.

Burgos KL, Javaherian A, Bomprezzi R, Ghaffari L, Rhodes S, Courtright A, Tembe W, Kim S, Metpally R, Van Keuren-Jensen K.

RNA. 2013 May;19(5):712-22. doi: 10.1261/rna.036863.112. Epub 2013 Mar 22.

 

 

 

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