隨著 NGS 技術演進,這項越來越成熟的技術慢慢促進許多領域的發展及快速成長,包括人類發展學、基因表現及調控、基因變異學及年齡與衰老相關研究等,未來更有可能影響醫藥、健康看護、疾病預防及臨床醫藥治療等領域發展。

    樣品製備成 library 提供 NGS 上機在這項技術占有很重要的地位,目前在操作 whole genomic DNA library 時,首先需要面對的問題是如何將 genomic DNA 片段化至適當的大小,並且必須盡可能使斷點隨機及減小 DNA 受損程度。目前常見的方式是使用物理性的超音波震碎,例如:CovarisBiorupter,或是使用液態壓力將分子截斷,例如:Hydroshear,除此之外,尚有使用特殊酵素 (fragmentase) 切斷 DNA 的方式及 transposon 插斷 DNA 的方式。

   微波爐加熱應用在實驗室工作上並不少見,它被使用在促進細胞裂解、加速化學反應,微波爐的放射線被應用在增加酵素裂解蛋白質反應速度,然而應用在處理核酸裂解方面目前則從未被實驗過,若能控制得並再現性高,想必可以同時擁有減少實驗時間及同時處理大量樣品兩項優點。

   微波爐的DNA 的片段化實驗以以下方式來進行,調整不同溫度及時間測試 genomic DNA 的變化,而常見的 Covaris 超音波震碎法以及較少見的高溫處理法被用來當作此項實驗的對照組,處理後以洋菜膠體電泳方式確認 DNA 分子大小分布。隨後,依照 Roche 454 library 製備標準流程建構 library,在 ligation 後的產物,使用 Bio-Rad real-time PCR 試劑分析並且同時放大總量,純化後再以 Agilent 2100 bioanalyzer 自動電泳觀察 library 分子量大小,最後以 Roche 454 pyrosequencing 系統上機定序及後續軟體分析數據。

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圖一

 

      如上圖一,處理後以洋菜膠體電泳方式分析,微波爐產生的電磁能量使得 DNA 被片段化而適合 NGS 應用,由上圖可知,隨著微波爐的溫度越來越高,DNA 的片段分佈如同加熱器處理後的結果一般,分子量明顯越來越小,但當維持在 95時,即使時間加長,微波爐的能量並不會使得 DNA 片段化明顯改變,與加熱器處理不同,由此結果可推知電磁能量對於 DNA 降解的效果與單純的加熱並不相同。為了進一步證實,因此使用能移除電磁波產熱的微波爐 (CEM Discover microwave system) 加以驗證,使用 150W95設定,以電磁能量照射 DNA,結果發現,隨著處理時間延長,DNA 受到能量後降解的速度加快了 (如下圖二)這是因為熱能被移除後,輻射能能持續增加照射能量所致,並且由膠圖可以觀察到 DNA 的斷裂片段分布均勻沒有特別的雜 band 出現,因此以微波爐處理 DNA片段化也許是一項新的好方法。

 

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圖二

 

然而,微波爐的電磁波,有可能會是一種造成 DNA 突變的能量,針對這一點,設計將上述處理斷裂的 DNA 拿去做成 454 library ,在圖三A可見到三種方式處理的 DNA library,分子量大約介於 500-800 bp 之間,但是當使用這三種處理的 library 上機定序卻發現加熱處理以及微波爐處理的 DNA 片段,在製備成 library 定序的讀長中,很明顯得無法獲得長 reads 的資料 (圖三B),但當三種 library 的定序所獲得的資料進行重組後發現,三種組成的 contig reference genome 皆有接近 100%的相似度。那麼,為何加熱處理以及微波爐處理的 DNA library 無法讀到如同 sonication 處理般長呢?微波爐的設計畢竟伴隨著產熱,而推斷無法讀長的兩種處理中的熱能,對於 DNA 可能造成潛在的傷害,這種 DNA 的傷害,可能會大大的影響 Taq DNA polymerase 的效率,也因此,雖然從 bioanalyzer (圖三A) 觀察不到異狀,但在使用 DNA polymerase 的定序中,造成了影響。

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圖三

使用微波爐進行DNA 片段化步驟雖然出現了缺點,但是這種缺失有可能能夠靠著 DNA 修補酵素彌補,例如:PreCR,又亦或能開發出完全移除產熱的微波爐,或是將 DNA 溶解在不含水的溶劑中,均有可能改善目前的缺點,在定序結果中也發現了一些好的優點,除了實驗操作方便之外,電磁能量能有效打開 DNA 的結構,並且減少 GC rich bias,對於實驗操作者而言,這是一種有趣及新的不一樣選擇。

 

 

參考文獻 :
Yang Y, Hang J. Fragmentation of Genomic DNA using Microwave Irradiation. J Biomol Tech 2013;24:98–103.

 

 

 

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