有勁的基因資訊

  
 
現今電腦科技的突飛猛進，早已跳脫摩根定律。2001年大導演史蒂芬史匹柏所執導的電影「AI人工智慧」，乃至於2004年威爾史密斯所主演的「機械公敵」，都是以智慧型機器取代工業與生活所需，工作面貌則呈現來勢洶洶的機器大軍。從法國工業革命到現代的產業革命，從半自動的設備躍升為智慧型的自動化儀器，機器始終扮演重要的角色。次世代定序科技（Next Generation Sequencing，NGS）的實驗操作，在智慧型機器化的氛圍薰陶下，也催生了全自動化實驗操作設備，本公司因應時代創新潮流，更是引進這套全自動的實驗系統『Ion Chef ™ System』，這台儀器好比一台五星級的主廚快餐車，定序DNA樣品都可經由 Ion Chef ™ 自動化的流程，進而完成定序前的處理作業，讓定序實驗的安排流程更有效率，品質更為一致性，亦省去人為實驗的時間束縛。機器人時代來臨，就投資角度而言，取代傳統人力，的確有助於企業長期獲利及產品穩定品管，這是未來勢在必行的方向，或許會發生不可預知影響，也可能會產生大量的取代事件，未來改變只會更快速，或許顛覆現在所想像，僅管如此，我們依然要充分準備好迎接智慧機器次時代的來臨。  

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為確保育種者的智慧財產權避免侵權事件、檢測作物是否為混合品種與協助追查農產品走私等皆需進行作物品種鑑定，因此良好的鑑定技術將有助於作物品種鑑定。
 
近年來國內已有多個單位透過簡單重複序列分子標誌多型性分析進行作物品種鑑定，以下針對簡單重複序列進行相關說明：
簡單重複序列 (simple sequence repeat) 簡稱SSR，又可稱為微衛星序列 (microsatellite)，是一種以2~6個核苷酸為一個 motif 的重複性序列，普遍存在於所有原核與真核生物基因體 (genome) 中。簡單重複序列於單一基因座 (single locus) 具有多重對偶基因 (multiple alleles) 與共顯性 (codominance) 遺傳的特性，此外簡單重複序列motif發生突變的機率相較於基因體的其他區域高，促使簡單重複序列於每個個體間存在著高度的變異性進而造就簡單重複序列成為鑑別度良好的分子標誌。

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自2005年Roche推出Roche/454 Genome Sequencer 20 System後，開啟了次世代定序的大門，經過不到10年的時間，第三世代的定序技術平台也問世了。本篇文章主要是介紹2010由Pacific Biosciences 公司發表的定序平台---PacBio RS，以及其定序原理---Single Molecule Real Time (SMRT) technology。
  
Figure 1. Zero-mode wave-guides (ZMWs) – small well-like containers & SMRT Cell & PacBio RS (擷取自http://smrt.me d.cornell.edu/FAQs.html)

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近年來，生物技術發展多樣性，以及許多高分子材料（如：奈米粒子）的研究精進，其中更以『磁分離（Magnetic separation）』概念的純化機制，結合分生、物理與化學三者合一，具實驗獨特性。此技術涵蓋範圍廣泛，在核酸領域的應用方面，舉凡：poly-A mRNA的分離、DNA的純化與次代NGS定序，都有此技術參與其中，除此之外，也可應用於蛋白質純化，免疫學等用途。分生實驗過程的核酸分離和純化，會因目的性不同，而於帶磁性奈米粒子的表面，鑲嵌不一樣的配體（ligand），以利進行結合與親和的反應，常見例如：結合poly-A mRNA的oligo-(dT)、streptavidin等鑲嵌配體。這類型的實驗分離方式，泛稱為SPRI（Solid Phase Reversible Immobilisation）是一種固相-液相可逆化固定的分離純化技術，比起矽粒子（主要成分為SiO₂）的分離更有效率，此項發明影響生命科學實驗的發展，有著舉足輕重的地位，亦逐漸成為現今NGS製備Library方面，於DNA的純化分離與分子量大小之篩選（size selection），不可或缺的一項工具，也是實驗步驟不可缺少的環節。

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A型流感病毒是人類最常感染的流行病毒 。以2009年發生大流行的H1N1為例，H1N1屬於A 型流感病毒，其病毒的基因是由人、鳥禽和豬的基因所組成。患有H1N1 的患者可能會有發燒、頭痛、全身性肌肉痠痛、咳嗽、喉嚨痛和鼻塞的症狀。而這種高度傳染的病毒有曾被世界衛生組織發出等級6的流行病警告。
由於病毒的高度抗原漂變(Antigenic drift )的能力，讓流感疫苗的效果有限。除此之外，病患若是同時感染兩種病毒，而使的不同病毒之間發生基因的片段重組(antigenic shift)，使的在2009年發現了新型的病毒變種，而造成流感大流行。
Oseltamivir (奧司他偉，俗稱克流感)是其中一種針對H1N1的神經氨酸酶(Neurminidase, 簡稱NA，主要功能是幫助新生成的病毒脫離被感染的宿主細胞)有效抑制活性的藥物。而A 型流感病毒具有Antigenic drift和antigenic shift的特性，在神經氨酸酶基因發生突變，所以在2007-2008年，雖然只發現少數的對克流感有抗藥性的 H1N1 病例，但而後發現之後的H1N1亞型流感有99.4% 幾乎都有抗藥性。
 

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SSR(simple sequence repeat)是指兩個或多個核甘酸重複排列，重複的核甘酸稱為一個motif，重複的次數在不同的個體或族群中會有所不同，為一種多型性(polymorphism)的類型；以Jun在大豆芽的研究為例，如下圖一，研究團隊收集了不同區域的大豆芽(soybean aphid)，分別在美國的俄亥俄州(OH)、伊利諾州(IL)、明尼蘇達州(MN)及加拿大的安大略省(ON)，可發現不同區域的大豆芽，motif重複的次數會有所相異。
 
 
在Jun的研究中，為第一個針對大豆芽的genomic DNA使用NGS定序後，經過de novo assembly後的contigs從中找尋SSR marker及比較在不同區域中的genetic diversity。同樣的分析概念也可應用於RNA-Seq，在Parchman的研究中，定序了黑松(P. contorta)的RNA，透過de novo assembly及reference-guided assembly後的contigs，來找尋SSR marker，圖二為Parchman研究中的流程，可供想做相關研究的團隊一個參考。

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    不久前炒得沸沸揚揚的社會新聞，「麥當勞驅趕唐氏症者」這個斗大的新聞標題，不僅震懾社會大眾，而且引發國內民眾高度的關注，由此事件讓大家重新審視唐氏症於社會上的待遇與生活情況。唐氏症（Down syndrome）這個名詞其實大家應該不陌生，最初由John Langdon Down 醫生，於1866 年首次發表此相關外表徵狀；接著在1959 年，由Jerome Lejeune 等遺傳學者發現該症狀是由於染色體缺陷所造成。所謂的唐氏症，簡言之，就是精或卵於減數分裂時所產生的非單套異常，使原本兩兩配對的23 對染色體(包含性染色體XX 與XY)，其中第21 對染色體有三條染色體的不成雙配對現象（即trisomy 21），造成細胞有46+1 條之染色體異常病變，這種患者會伴隨智能障礙等現象，唐寶寶的照料其實會對家屬造成終其一生的心理與經濟之負擔。因此，如何在懷孕初期預防此種染色體異常的胎兒出生，無論是對家庭或是社會，無一是正面的消息。

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腦脊髓液是直接與人類大腦或神經接觸的體液，所以在研究或臨床診斷神經性病變、中樞神經腫瘤、腦部創傷及腦膜炎等疾病時，皆會進一步探究腦脊髓液的內容物，若其中存有大量特殊蛋白、細菌、異常顏色或細胞，可協助醫師執行後續治療策略，在研究上，亦能輔助判斷疾病的致病機制。
目前已有許多研究利用次世代定序分析血漿內游離的miRNA，其具有潛力做為許多疾病的marker，本部落格在先前文章已有介紹。針對腦脊髓液內游離的miRNA，多數研究是利用qRT-PCR研究，例如在阿茲海默症有被發現miRNA表現情形與正常人不同，但較少利用次世代定序研究腦脊髓液的miRNA，此主因為每個病人一次取得的腦脊髓液有限，這些腦脊髓液含有的total RNA總量極為稀少，而miRNA又以極低量存在這些微量total RNA中，所以導致實驗執行上的困難。
Kasandra Lovette Burgos等科學家為突破此困難，首先，他們先找尋最適合萃取腦脊髓液游離RNA的試劑，其應符合高回收率、無RNA長度的限制及操作方便性，作者先以性質類似的血漿做為測試的樣品，比較各式萃取試劑的回收率，結果如下圖，在200 ul的腦脊髓液內，回收率較佳的試劑組為mirVana、PARIS mirVana、Qiagen miRNeasy及BiooPure，約能萃取到15 ng的total RNA。

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NGS不僅可以協助物種解序更可以幫助癌症研究與臨床應用，就如下圖所顯示的有RNA-seq與ChIP- seq …..等等，提供更多訊息來瞭解cancer genome與設計出個人化的治療。

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RNA病毒是許多重要疾病的致病源，包含AIDS、流感、SARS等造成大眾健康威脅的疾病。常用標準的檢驗方式，仍需要依靠已知的核酸序列或者蛋白質抗原資訊來完成檢驗確認；近年來次世代定序技術發展快速，可應用於新興未知的病毒鑑定，然而真正應用於臨床上仍有其困難點，由臨床樣品抽取得到的核酸量通常很低且品質很差，並且包含大量非感染源的核酸，會造成分析上的困難，無法正確de novo出真正病原的genome。
本篇研究[1]以愛滋病毒(HIV)、西尼羅病毒(West Nile virus)以及呼吸道融合病毒(respiratory syncytial virus)作為樣品測試，在實驗部分使用SPIA(single-primer isothermal linear amplification)的技術放大核酸，在生物資訊分析的部分使用VICUNA組裝程式，將上述三組病毒，原始核酸總量介於femtograms到attograms之間，成功組裝出其完整的”基因序列”；此研究開啟了NGS實際應用於臨床檢驗的大門，對於未來可能發生的新興病毒檢測，有極大的助益。

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Next Generation Sequencing 這個名稱是相較於傳統定序技術而言。
傳統的定序技術包括:

Chemical Sequencing

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心肌病(CVD)是指伴有心肌功能障礙的心肌疾病。這類心血管疾病各個國家中一直是罹病死亡的主要因素，在2005年在全世界約有30%的死亡人數(約1700百萬)離病死亡。新聞常常看到有青壯年發生心臟性猝死。這些情況常常是突發的心悸、暈倒之後休克，較嚴重的可能會無預警的猝死；但是病患在平常是很難被診斷出來的。單光在歐洲，就有48%的人死於心血管疾病，也造成23%的醫療負擔。儘管現代醫療管理方面進步，像是CVD的預後、致病機制研究和尋找潛在治療方法仍非常重要。

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