有勁的基因資訊

定序的技術不僅讓英國科學家 Frederick Sanger 於諾貝爾化學獎梅開二度外，亦深深奠定往後次代定序 (Next- generation sequencing, NGS) 的基礎，此項技術將生物、化學與電腦運算三者整合為一，徹底改變多樣化的基因組應用，更帶來劃時代進展，其目的無非是將生物體內大量的有字天書作趨近於完美的詮釋。為了因應大量序列數據的辨認，因此發展出條碼系統(Barcode system)，拜此辨識概念的引入，即允許混合多數樣品並於同時間進行大量定序(Bystrykh, 2012)，本文主要探討條碼對於次代定序的貢獻，從日常生活的有形化乃至生技層面的無形化，比比皆是，隨處可尋條碼的蹤跡，可見其對於人類生活息息相關，以下分三部分做詳細介紹：
壹、日常生活應用

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近幾年來肺癌成為前十大癌症死亡率最高，原因是現今社會中由於空氣汙染嚴重、二手菸或是因為工作關係長期處在於大型廢氣排放設備的工作區域等等，又加上肺臟本身沒有痛覺神經，所以當發現肺部有異狀時通常癌症已經轉移到淋巴或其他組織。
肺癌與其他癌症的治療方法不外乎就是化療、標靶等等，而近年來國內掀起一陣風潮，就是由基因定序來協助治療肺癌。在2010.09.14的中時健康網(http://health.chinatimes.com/contents.aspx?cid=6,60&id=11649)曾報導過，台北醫學大學附設醫院透過國內外文獻，推出全台首創肺癌基因定序篩檢，癌症患者只要透過基因篩檢就可以找到最適合自己的治療方式或是藥物使用，這樣一來不僅可以對症下藥還可以減少一些治療的時間。在國外早就在2008年Campbell等人在文獻中提利用全基因體定序協助肺癌的研究，接著分別在2010年與2011年陸陸續續都有相關的文獻出爐，如下表
 

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我們對於數位資訊儲存媒體的容量需求一直不斷地增加. 以硬碟容量而言, 從30年前一顆數十MB, 到今日一顆數TB的硬碟, 儲存的密度可以說增加了數十萬倍. 即使有如此大的進步, 我們對於更大容量的儲存設備還是有需求.

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    次代定序( Next- generation sequencing, NGS ) 的技術自發展以來，應用層面相當之廣泛，舉凡：學術研究、醫學檢測、藥品查驗以及考古起源等…，日新月異的定序技術發展之下，使得原本躓礙不前的考古科研有另一層突破性進展，本篇主旨探討利用NGS 巧妙的運籌帷幄，一窺歷史的跡象，揭開對古代生物迷思。古人曾云：「以史為鏡，可以知興替」。古老生物的遺傳密碼在NGS 抽絲剝繭下，間接了解生物演進，這些遠古的遺傳物質aDNA ( ancient DNA ) 經長年累月的歲月摧殘，會產生一些自發性的變異及損壞 ( 如：氧化、水解與 DNA crosslink )，或因外發性的降解 ( 如環境中的微生物所分泌核酸水解酵素，直接崩解 DNA 結構)。形成aDNA 三個主要特性：短片段、嘌呤丟失作用( depurination ) 與去胺基作用( deamination ) (Sawyer et al., 2012)，亦在先前之『利用NGS觀察DNA降解現象』一文中，詳細敘述相關的發生過程及原理，但這些現象往往左右定序的正確性，容易造成鹼基配對錯誤 ( misincorporation 或稱 miscoding lesions ) 現象，導致產生錯誤的序列訊息，以下就由三方面的研究作介紹。

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傳統中藥醫學(Traditional Chinese Medicines ,TCMs)，於博大精深的中國已超過3000年載的使用歷史，隨著日新月異的醫學科技，訴求自然之傳統中醫業已與速效的西醫並駕齊驅，很多醫學觀念亦紛紛導向中西合璧之途，在各種醫學評估及試圖尋找西藥替代品的情況下，中草藥勢必為首選。而中藥產品的日益普及，與其接受度漸趨增加，也使得產值逐年水漲船高，消費者除了注意藥品安全問題外，亦衍生出藥物來源合法性之問題，但往往在選購中藥產品時，看見的只是包裝的成分內容，附註之藥品標籤是否誠實，亦或其中隱藏很多摻假不實的添加成分，皆無從得知，而消費者就可能成為這場交易中的蒙蔽者。甚至有不肖商人，利用違法的瀕臨絕種動植物為藥材，或添加禁止入藥之植物萃取物試圖魚目混珠，這些非法行為都可能導致消費者身體損害或後遺症。迄今，鑑識中藥內容方式，雖可鑑別出植物成分，但也侷限於已知標準品的範圍，欲知其確切來自何物種仍有難度，因此，要如何有效把關這些市面上流通的中藥產品，本篇作者將中藥檢驗結合次代定序 (NGS) 平臺，探究每種藥品中所含之 DNA 種類，將其序列與已知動植物之 DNA 資料庫進行比對，利用此方式作者成功鑑定出中藥成分的物種來源。此外，為了達到保護野生動植物的永續發展，也結合瀕臨絕種野生動植物國際貿易公約，探討這些中藥來源的合法性，作者分析由澳洲海關人員所查扣包含粉末、錠劑、膠囊與草藥等多種違反當地環境法之中藥製品 (圖一)

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病毒在生物界扮演著舉足輕重的地位，幾乎所有的生物都能被特定的病毒所感染。而昆蟲同樣對於生物界以及人類非常重要，保護對人類有益的昆蟲，以及研究傳播病害的昆蟲是非常重要的事，例如：保障蜜蜂以及幼蠶的健康、探究疾病媒介昆蟲的帶毒，或是利用病毒製作生物性殺蟲劑等等，都是科學家們努力研究昆蟲病毒的目的。
   在過去，科學家們已花了許多時間研究昆蟲體內所帶的病毒種類，然而，並非所有的病毒都能夠被傳統的實驗技術所偵測到，過去常用在研究昆蟲病毒的技術包括了：直接觀察的TEM、血清學的ELISA、以核酸雜合為主的Southern、Northern blot，也有人直接分析 EST Library 的序列，找出新的病毒，不過這會受限在病毒濃度高的狀況下，後期常見有人使用 Microarray 技術監測如蜜蜂族群的帶毒率，但這項技術受限在只能偵測已知的病毒種類。
   如今，結合上新的次代定序系統，許多在蟲體內的微量病毒都陸續的在過去五年間被檢測到。由於次代定序系統有著快速、相對傳統實驗方式價廉的優點，以及可獲得高通量和正確性高的序列資料，因此即使看不出病徵的染病昆蟲，都能夠被有效的被偵測出微量的帶毒，所以次代定序系統可被用來當作一種監測病毒感染節肢動物們的有利工具。在製備 DNA 或是 RNA 材料時有兩種選擇，可以直接使用所有樣品的核酸製備，或是純化出病毒顆粒後再萃取核酸，後者的好處是可以避免掉寄主核酸的汙染，不僅如此，寄主進食食物上的病毒、還有被導入寄主基因體的病毒基因，都可以避免以減少誤判的可能性。

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基因的轉錄後調控常常發生在mRNA的3’UTR，近兩年許多團隊透過NGS技術來研究3’UTR的調控及演化，並發現了新的調控機制。以線蟲為例，由於線蟲大部分基因的3’UTR缺少註解，Calvin H.Jan 等人在2010年透過3P-Seq的方法將RNA尾巴位置透過NGS技術定序後，經分析發現高比例的A/U序列內容會促進線蟲基因體的壓縮 ( genome compaction )，因為造成切割的因子是A/U高比例的，也因此他們容易在A/U高比例的序列內容中出現。事實上30%的protein-coding基因有不同的mRNA型態 ( alternative mRNA isoform )，另外在尾巴距離很近但不同的切割位置以往都是被忽略掉的，作者發現大量的這種isoform可能是線蟲3’UTR在演化上逐漸變短的中間物。甚至作者發現三分之一的匯聚基因對( convergent gene pair) 在3’UTR重疊的地方，將具有正負股雙面功能的因子在序列上做回文的排列，這個現象節省了基因之間的距離，造成基因體的壓縮。雖然線蟲3’UTR的長度只有哺乳動物的六分之一，但線蟲具有保留性miRNA位置的密度是哺乳動物的兩倍。部分是因為有更多類型的種子互補位置 ( seed
complementary site ) 較傾向被保留。這些發現揭開了切割與多聚腺苷酸化對基因結構演化的影響，也提供了研究後轉錄基因調控的資源。


透過3P-Seq方法確保oligo(dT)是和3’UTR的polyA接合，而不是internal
polyA的序列接合。

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一直以來，癌症研究中一直缺乏能夠在早期判斷罹癌的指標，如今相關研究有了一項新的進步。臨床醫學的癌症病人檢體中，有一個特別的現象，在病人癌組織以及正常組織中的 miRNA 組成種類會產生變化，但是由於癌組織採取十分不方便，因此可能癌症已進入末期才被發現。如今科學家們，在病人血液、尿液、唾液等檢體中發現也能觀察到這個現象，miRNA 隨著體內循環系統循環而容易被醫檢系統取得，如此也許能替癌症預防多了一股新的曙光！
許多的癌症在初期並不明顯，不易被偵測檢驗，而癌細胞隨著人體內循環系統：血液、淋巴腺等轉移，很多病例在發現出現症狀時，往往都是轉移後癌末惡性腫瘤。2011 年 1 月發表在 Journal of Biomedicine and Biotechnology 期刊上有一則相關的研究被報導，QianWu 等人研究乳癌病人的罹癌組織與健康組織 miRNA 之區別時，使用次世代的定序系統列出所有在罹癌組織被大量形成的
miRNA 種類 (下圖)，超過 2 倍以上則視為有差異。再更進一步的嚴格限制，以超過五倍以上的 miRNA 當作模板，設計出 qPCR 需要的引子對，用來偵測其他乳癌病人的血漿。結果發現，編號
miR-29a 以及
miR21 在血漿中也能大量的被偵測到！
 

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癌症的發生主要是細胞基因發生變異，常見的是在染色體內或染色體間發生相互重組的現象，而導致染色體結構的不穩定。根據研究指出¹ (圖一)，即使是同一種癌症，在不同病患內的癌細胞顯現出的基因變異模式皆不相同。因此，為了防止病患接受不適當的抗癌藥物治療，導致化療後不但沒有成效，更受到副作用的侵害，癌症的治療需分析每個病患基因變異的模式，針對每個病患特有的變異做最精確的抗癌藥物篩選，除此之外，找出的變異區也可做為後續診斷的依據。
 

圖一

以往要得到人類細胞全基因體的序列是非常困難的，因此在臨床上現有分析癌細胞基因變異特性的方法，僅侷限於與生長週期有關的重要基因部分片段，而無法巨觀的了解整個癌細胞所以變異的狀況。直到近年來，次世代定序技術的成熟，配合mate pair sequencing的技術(關於mate pair請按此)，能在短時間內及較低成本的狀況下，了解病患癌細胞基因體的重組狀況。Rebecca J. Leary研究團隊在2010年提出的personalized analysis of rearranged
ends (PARE)²，即完整表達上述的治療策略(圖二)

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NGS具有高輸出量的特性，而且不需經過bacterial cloning的過程，這兩種特性使得定序的成本大大得降低，至2010年底，以Illumina系統為例，定序成本，每1bp約只需要花費新台幣0.0002元，遠低於Sanger sequencing成本0.2元/bp。NGS所具有的高輸出量與高解析度特性，使其應用範圍也日趨廣泛，遍及基因體學、生物醫學、環境科學等研究 (上圖)；而利用NGS 系統的研究論文也越來越多 (下圖 橘色線)，數量呈現對數成長，反觀Microarray與QPCR，研究論文的數量已經趨近於飽和 (下圖 藍線與紫線)，而利用Southern與Northern
bolt的研究論文數量有下降的趨勢 (下圖 淡紫色線)，這說明著NGS的時代已經到來，NGS技術已成熟且普及化，解決了從前的技術無法解決的難題。
 

 

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Illumina (Genome Analyzer)與Roche (454)皆是次世代定序儀(Next Generation Sequening , NGS )，兩者的基本原理離不開sanger的鏈終止定序法(chain termintin)，但是卻有不同的定序原理。
 
 
 

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前列腺癌是美國癌症比例第二高的癌症，然而，前列腺癌細胞內發生的基因變異卻尚未被完全了解。直到近年次世代定序技術的蓬勃發展，科學家才得以解序癌細胞內的全基因體序列，進而深入探討前列腺癌細胞的癌化機制。

        Michael
F. Berger等人在2011年二月發表在知名期刊nature的”The genomic complexity of primary human prostate
cancer”，其研究團隊以次世代定序平台GA2x解序七位罹患初期前列腺癌病患的癌細胞全基因體序列，研究發現前列腺癌細胞基因體有非常複雜的重組現象，如下圖，例如染色體21內，原本只會出現在紅色區域內的DNA序列卻出現在橘色區域中，而橘色區域的DNA片段也有轉移到紅色區域的情形，除此之外，不同染色體上的DNA片段也有相互交換的情形，例如正常細胞中僅會出現在第21對染色體之橘色區域的DNA序列，在癌細胞中出現在第1對染色體的黃色區域內。另外，下圖也顯示了在正常前列腺細胞內的基因體結構並沒有DNA片段位置轉移的現象。這些結果顯示前列腺癌細胞的基因體內，有著非常高頻率且複雜的重組現象(genomic
rearrangements)，並且這些重組現象與癌化過程有很大的相關性。
 

癌細胞內發生的重組中，產生的斷點若發生在具有重要功能的基因區域，便會導致基因失去功能，或是產生不具正常生理功能的融合基因。下圖顯示重組產生的斷點發生在許多與癌化基因有關的區域，值得一提的是，在抑癌基因(tumour
suppressor gene)的PTEN及與PTEN抑制癌症有關的MAGI2中，存在因為重組而產生的斷點。
 

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