有勁的基因資訊

    定序技術不斷推陳出新，自諾貝爾化學獎得主Frederick Sanger起，迄今核酸定序之成本、時間與技術，也逐年的縮短與降低。本篇主要介紹半導體對於定序的應用，其中喬納森•羅斯伯格（Jonathan M. Rothberg）扮演著舉足輕重的角色，他是位專精於生物領域的發明兼企業家(圖一)，同時也是454生命科學公司（454 Life Sciences）的創業者，成功研發焦磷酸測序技術（pyrosequencing），就在羅氏公司（Roche）併購了454生命科學公司的同年，他創立Ion Torrent公司，羅斯伯格本身亦是蘋果公司創辦人賈柏斯 (Steve Jobs) 的推崇者，因而從IT （Information technology）角度捕捉靈感，進一步將半導體微晶片的概念，跨領域的導入定序技術中，不僅在基因定序領域中具有開創新穎性，其所創造的生技經濟效益，更被富比士財富雜誌評選為封面人物(圖二)。

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火星一直被許多人討論可能會在數十億年前有生命體的存在，甚至上火星的探勘器有發現疑似是水的流路或冰河痕跡，所以更有科學家大膽推測地球上的生命是源自火星。當然這些討論及假設目前並沒有確切證據可以證實，但回歸到地球生命的本質，DNA及RNA架構了生命體，所以找尋火星上是否有DNA或RNA的存在，並且進一步定序，可提供科學家許多的資訊來找尋生命的蹤跡及推斷生命的起源。若直接由火星採集樣品再回地球執行定序，在時間上會非常耗時(來回火星及地球就要耗費數年)，除此之外，DNA及RNA也有可能在運送過程中降解，所以研究人員希望能夠直接在火星上執行定序，稱之為in situ Life Detection，如此可立刻知道定序的結果，若有問題亦能立即再採樣。
        麻省理工學院Christopher E. Carr研究團隊提出使用次世代定序系統執行in situ Life Detection任務的概念，並且認為相對較為單純的無光學系統半導體定序技術是較為適合的平台，然而在外太空輻射線充斥的環境下，可能會對於定序過程有所影響，因此，他們將Ion torrent的314 chip處理各式各樣強度及種類不一的輻射(Fe-56, O-18, H-1)，並進一步分析其產生的影響，實驗設計如下表所示，總共40片的chip，其中20片用電子的方式測試輻射照射前及後的影響，另外20片經輻射照射後，直接拿來定序E. coli的DNA，並且分析定序結果。
 
 

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Biocomicals (網址：http://www.biocomicals.com/comics/，生物相關漫畫部落格)

此網站由一群具有科學和醫藥背景的網路漫畫家所組成，透過開放式的創作平台，將各種有趣的構想圖像化，平均一周有3~4篇的漫畫產出。更多有趣漫畫請連結至該網站觀看
  

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相信許多人都看過侏儸紀公園這部電影，藉由DNA的解序有機會可以重現已滅絕的生物，然而，現階段的生物技術實現侏儸紀公園的場景，還有一大段路要走，主要原因便是DNA品質問題，化石內的DNA遭受了千百年，甚至上百萬年的氧化、水解等化學反應，DNA的化學結構已經有明顯的改變，不但，破碎且含量非常微少，這篇文章主要是要來探討古老DNA定序所面對的問題。下述三個類型的化學反應是在化石中常見的。
1. Hydorlysis
這會發生在DNA磷酸與Purine的位置。

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非洲裸鼠 (Naked mole rat) 學名：Heterocephalus glaber 是一群在東非地底底棲生活，大小約 8-10 cm，重約 30-35 g 的鼠輩，牠們擁有一般地底生物常見特性，例如：耐熱、耐 CO₂、視力不佳、能敏銳感受震動，牠們進行鼠類中少見的團體生活，並且具有哺乳類動物中唯二的真社會化系統 (Eusociality)，只有女王鼠能與少部份雄鼠繁衍後代。

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真核生物rRNA包含28S、18S、5.8S、5S四種rRNA，一般在判斷RNA是否有降解時，會去觀察28S與18S rRNA的狀況，在RNA品質佳的狀態下，28S rRNA總量應為18S rRNA的兩倍左右，如下圖分別為哺乳動物的RNA proflie，
  

植物的RNA可以觀察到除了最明顯的28S與18S rRNA外，還會有其他peak的存在，這是因為來自葉綠體的rRNA造成的現象，如下圖所示。

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NGS 的高輸出量特性，帶給基因體學研究上的突破，然而，目前技術仍有存在一些缺陷，其中最令人詬病的點是定序深度不均勻，造成 NGS 必須提升定序深度，來彌補定序深度不均勻的問題。造成定序深度不均勻的原因很多，其中最明顯的就是序列 AT 或 GC bias 造成，往往 high AT 或 high GC 的區域很難得到滿意的定序品質與定序深度；有一部分的原因很可能是 library 製備過程中造成的，一般 NGS DNA library 製備流程包含，fragmentation、end repair、A-tailing、adaptor ligation、PCR 等步驟，製備流程中，所有的環節都有可能會造成bias，當然包含每一個純化的步驟。為了釐清到底是哪一步驟造成，Aird 團隊利用 QPCR 來檢驗 library 製備流程產生 bias 的情況 (Aird et al. , 2011)，結果整理於圖一，縱軸是序列的數量，橫軸是 GC content 的百分比。由圖一可以清楚地觀察到，library 製備的流程中，PCR 過程是造成 bias 的主要原因 (圖一)；而 fragmentation、end repair、A-tailing、adaptor ligation 等步驟，不太會產生 high AT 或 high GC 的區域定序深度下降的問題。
圖一
 
要讓定序深度更加平均，從 PCR 步驟進行改良將是最有效率的。當然製作 PCR free 的 library 一定是最有用的方式，除此之外，還有三種方式來改善 PCR 造成的問題:

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融合基因 (fusion gene) 經常發現在血癌、前列腺癌及軟組織肉瘤中，並且有越來越多證據顯示與導致該癌症的發生有關係。融合基因的形成是由於染色體發生了易位 (translocation) 、刪除 (interstitial deletion) 或倒置 (inversion) 所造成，融合基因所表現的融合蛋白 (fusion protein) 在功能上會有所變異，以慢性骨隨白血病 (Chronic myelogenous leukemia) 中 BCR-ABL  融合基因為例，BCR-ABL 會表現成 tyrosine kinase 並活化細胞周期調節系統中的控制週期蛋白，加速細胞分裂，並抑制 DNA 修復，導致病變，並且在 95% 的患有慢性骨隨白血病的病人中皆有 BCR-ABL 基因，因此可當成 biomarker 來判別是否罹患慢性骨隨白血病。


 應用 NGS 的技術在 RNA-seq 上，陸續有研究在癌症發現新的融合基因，Michael F. Berger 等人在2010年使用 GA2 定序了 10 個皮膚癌樣本的 RNA-seq，從中首次發現了融合基因，對於皮膚癌在生物調控上的機制給予新的觀點及突破。
 

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在 RNAi 的原理漸漸被了解發現的同時，許多研究病毒的學者很快就嘗試運用這個天然的機制，來控制病毒在寄主體內的複製與發病。由於許多造成嚴重病害的病毒以 RNA 病毒為主，因此在植物病理學上，亦或是醫學上，都曾嘗試過使用 RNAi 的機制，抑制病毒的複製或是表現蛋白。在 Fire 和 Mello 研究中提到過 RNAi 的反應會經由少量的雙股 RNA 觸發，並放大擴散整個效應，而在後續的研究中，逐漸了解這是因為雙股 RNA 被酵素—RNase H剪切成為小分子的 RNA 片段，被稱為“small RNA”。這種小分子的 RNA 的反股會跟細胞內的複合物 RISC（RNA-induced
silencing complex）做結合，進而專一性的降解所有與這些小分子 RNA 互補的 mRNA
序列，使寄主達到如同免疫的效果。


    RNAi 應用在醫學領域治療病毒所引起的疾病，首例是用在治療 HIV 所引起的愛滋病，HIV 是一種 RNA 病毒，但是由於病毒都具有高度的突變性，因此使用專一性高的 RNAi 來抑制不斷改變的病毒核酸有些困難，但所幸 HIV 在人體感染的途徑已被研究得非常透徹，因此科學家們改變策略不嘗試抑制病毒本身的複製或是蛋白質表現，而針對病毒辨識人體細胞膜外側的 CD4 和 CCR5 receptor 作抑制，當體細胞膜不再具有可被病毒辨識的
receptor 後，病毒便無法轉移感染健康的體細胞，達到治療的功效。

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1990 年，一群植物生理科學家—
Richard Jorgensen 的實驗團隊，嘗試在矮牽牛 (Petunia)
上增豔花朵顏色，而它們使用的策略是現今發展相當成熟的農桿菌轉殖基因技術以及組織培養技術。chalcone synthase (CHS)，是一種開花植物形成花青素的化學路徑上，決定合成效率的關鍵酵素，當時，Jorgensen 使用高效能之 35S promoter 來大量表現矮牽牛之 CHS 酵素，他期望能產出色澤更為飽滿的美麗矮牽牛，但結果卻令他萬萬想不到。
 

在 Jorgensen 的研究報告中顯示出，他所得到轉基因矮牽牛，不但花色沒有變深，甚至高達 42％ 的矮牽牛出現白化、白斑、白色嵌紋等性狀，這個結果告訴了他一個事實，植物體內啟動了某一種未知機制，不但抑制了他所轉殖的基因表現，也抑制了自己本身該正常表現的CHS 酵素。在當時，這個現象在植物上被稱為共同抑制（co-suppression）。

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