有勁的基因資訊

     Single Molecule Real-Time (SMRT) sequencing發展至今，的確在讀長方面相當優勢 (約 5K-10Kbp)，但是在定序價格無法降低的情況下，許多狀況並不合適完全取代次世代定序儀，例如：metagenomics 的定序。近年，10X Genomics 導入這套系統甚至可以產生 50 Kb 組裝後序列，但原理細節對外部並沒有公布，而 Illumina 也增加了一種新的 library 製備方式來獲得近似第三代定序儀讀長的結果，商品名稱為 TruSeq synthetic long read (TSLR) technology。這項技術使用過去 BAC library 這常用來研究物種基因體的觀念，將龐大複雜的基因體切割成許多小部份，只不過每一小部份相較於 BAC，insert 增加至 Kb 以上的單位來做次世代定序。
    目前常見的兩種 Long fragment reads library 製備方式，均不需要真的 cloning放入細菌載體中複製，但會將 Kb 為單位的片段打碎後掛上各自的 barcode，再藉由後端解讀barcode，將定序的資料重新分群後以 Kb 為單位組裝，重現近似第三代定序儀讀長的結果。無庸置疑的，在定序未知物種基因體的 de novo assembly 上相當的有幫助，尤其是能跨越重覆序列 (repeat sequence) 來幫助組裝，除此之外，由於多數物種基因體為多倍型染色體，例如：人類是二倍體 (Diploid) 生物，幾百 base-pair 的讀長有時可能無法正確判斷基因座落在何條同源染色體上，如今，這項技術應用在人類染色單倍體分類 (Haplotyping) 研究，甚至能追溯親代基因型的遺傳。

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NGS技術中，降低錯誤率一直是很重要的一個環節。尤其是在癌症領域、法醫鑑定、遠古生物的基因體學、cell free DNA應用、metagenomics應用等領域，目標就是要正確地偵測到頻率很低的變異點位。也因此在實驗方法上如果會造成非特異性的錯誤率太高，就會無法正確的將非常稀有的變異點位找出來，這樣的點位會淹沒在非特異錯誤之中。

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在2013年底，Nature Method 期刊將單細胞定序選為年度技術。在發育生物學、腫瘤基因體學、生殖醫學等領域，單細胞定序技術已經開始發揮它的威力，為我們帶來許多珍貴的訊息。本篇主要著重於此技術在當前的現況，介紹目前的單細胞分離技術、放大技術、與一些應用的面向。第一部分將先介紹技術的部份，第二部分將整理一些已發表的應用情形。
單細胞定序的流程，大概可分為1. 單細胞分離，2.依照不同的需求放大樣本進行定序。可以參考圖一。
 
 圖一 單細胞定序的流程(圖片來源: Single-cell sequencing Vol.11 No.1 | JAN 2014 |Nature Methods)

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在Ion torrent 定序平台中，要定序之前，要先做出成功的 emulsion PCR，才有可能有好的定序品質 ， 但首先要克服以下情況:
        1.  Micro-reactor 必須有一致的大小 :
emulsion PCR 是利用油滴包覆Emulsion PCR 必須所含的物質，包含Bead、 一條 DNA template、d NTP、DNA polymerase、co-factor 等等。這樣的一個反應油滴我們稱之為 micro-reactor。一般而言，micro-reactor 的大小約在 20-30 um ， 這樣的大小已經足以提供 Emulsion PCR 一個很好的反應環境。 micro-reactor 若是太大，就會容易造成 polyclonal 的形成 ( 即一個micro-reactor 裡面含有兩條不同的 DNA template，使同一個bead上會有兩種不同序列的 template，造成定序時判讀微弱或混亂 )。

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實驗上，我們時常使用 Polymerase Chain Reaction (PCR) 這項技術增幅目標核酸片段，這在建構NGS gDNA 或cDNA library時亦是其中重要的一環，然而實際上，進行 PCR 會因為兩種現象而機率性地產生非預期的結果：第一、在增幅過程中，片段小的 template 會傾向較容易地被放大；第二、經 PCR產生的產物有部分序列相似時，它們會在 annealing 的步驟中發生部份的雜合配對，而在extension 的步驟被 polymerase 延長，進而產生 chimeric副產物。此外，PCR 的過程中有時會伴隨 primer extension 不完整的產物產生，這樣的產物會在前述的部分配對中，在下一個 PCR cycle 繼續的被延長，但產生大小不一的 chimeric副產物。眾多的 PCR protocol 考量到上述現象，會適當地調整步驟，例如：提高 DNA模板的濃度或是降低 PCR 的 cycle 數，然而，當面對模板 DNA 極微量的情況時，就很難避免 PCR cycle 數的增加，而提高 chimera 出現的風險 (圖一、左)。
針對上述傳統 PCR 的弱點，新式的 PCR 方式被開發出現，利用油水不互溶的特性，製作出許多微小的水滴散布在油類溶液環境中，各種序列不同的模板 DNA 分子被隔離分開至各水滴中，每個水滴均為水性緩衝溶液並包含 PCR 過程所需的材料：DNA polymerase、primer、dNTPs，在適當的比例調配下，每個微小的水滴可少至僅含一條模板DNA 分子，使得每個水滴中的 PCR 反應互相不影響，只會忠實的放大同一條模板分子，所有的 PCR 產物平均地生合成且不會再因部分配對的雜合而被錯誤放大，PCR 反應材料不需競爭、也不因酵素催化的喜好性而出現偏向，徹底解決前述傳統 PCR 的問題 (圖一、右)。

 

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在實驗過程中多多少少會遇到一些問題，例如有兩個分別貼上DNA及RNA標籤的樣品，在實驗過程中標籤都掉了此時該如何分辨？
也許分辨的方法不只一種，但其中一種是可以利用溶液PH值的酸鹼來辨別，首先將兩管樣品分別取出一些加入鹼性溶液中，再去跑膠則就可以判斷出哪一個為RNA。
RNA在鹼性環境下會有不穩定的現象，甚至會產生降解的情況，其原因是RNA 2號碳上的OH基會受到鹼性溶液(OH-)攻擊，而則造成phosphodiester bond 遭破壞而斷裂行成2’，3’-cyclic monophosphate derivative(如下圖)，所以在分子生物中PH值是很重要的介面之一。

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在 RNA 樣品製備 NGS 定序上機的前端作業方面，Illumina 所採用的方式是使用 Oligo-dT 來篩選出帶有 PolyA tail 的 mRNA，然而這種方式面對品質較差的 RNA 時，將會受到限制，並且一些不帶有 PolyA tail 的 mRNA，將無法被觀察到，因此有其他廠商使用其它的策略發展新的製備方式，如：NuGEN Ovation，它可以使用少至 500 pg 的 RNA 來完成 library，並且即使 RNA 品質較差，依然可以適用。

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在現今科技進步的社會中，NGS除了扮演尋找SNP與mutation或是de novo sequencing…等等也讓科學家縮短了研究各式各樣基因圖譜的時間。但很遺憾的是目前NGS的前置作業也就是製備library的方法，並沒有可以完完全全代替人力的自動化系統來完成library，因此為了彌補這項缺失Hanyoup Kim,et al.等人開發針對illumina定序平台的自動化library製備系統，此系統稱為microfluidic system，這套系統結合了droplet-based digital microfluidic (DMF)，所以library製備可以在此系統完成。(如下圖)
 
a. 指microfluidic system，而右上角長條狀的圖示則表是DMF-capillary interface。
b. 左邊圖示原理圖，右邊則是利用microfluidic方法製備DNA library的說明圖。

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    隨著 NGS 技術演進，這項越來越成熟的技術慢慢促進許多領域的發展及快速成長，包括人類發展學、基因表現及調控、基因變異學及年齡與衰老相關研究等，未來更有可能影響醫藥、健康看護、疾病預防及臨床醫藥治療等領域發展。
    樣品製備成 library 提供 NGS 上機在這項技術占有很重要的地位，目前在操作 whole genomic DNA library 時，首先需要面對的問題是如何將 genomic DNA 片段化至適當的大小，並且必須盡可能使斷點隨機及減小 DNA 受損程度。目前常見的方式是使用物理性的超音波震碎，例如：Covaris、Biorupter，或是使用液態壓力將分子截斷，例如：Hydroshear，除此之外，尚有使用特殊酵素 (fragmentase) 切斷 DNA 的方式及 transposon 插斷 DNA 的方式。

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急性骨髓性白血症 Acute myeloid leukemia (AML) 通常是由於體細胞的基因突變所造成，尤其是早期進行造血作用 (hematopoiesis) 的stem cell 和 myeloid progenitor cell。而 FLT3  這個 receptor的異常在 AML 的形成中扮演著重要腳色，尤其是含有FLT3 ITD (Fms-like Tyrosine Kinase-3 Internal Tandem Duplication)的病例在AML 中所佔的比例約有 20-30% 的高比例，其餘則是 point mutation 所造成的基因異常，例如在 D835。

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隨著NGS次代定序的技術不斷的推陳出新，其能力所涵蓋的層面亦越來越豐富，但一套完整的NGS，其構成的條件，不單只有最新的定序儀器就足夠，定序核酸樣品的良劣往往左右最後定序結果，所謂工欲善其事，必先利其器，要怎麼收穫就要先怎麼栽的道理。本篇文章主要淺談游離核酸(Cell-Free nucleic acids) 的品質對於NGS定序之重要性。在醫學方面，以游離核酸的研究漸趨深入，其為一種細胞外呈游離狀態的小片段核酸，存在於血液、尿液與唾液等…，大部分可經由三種方式：細胞凋亡（apoptosis）、細胞壞死（necrosis）與胞泌作用（secretion）進行胞外釋放(圖一)，其中又以游離DNA (Cell-Free DNA，cfDNA) 應用於癌症腫瘤監控及胎兒產前的診斷(圖二)之進展最為豐富。

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    自從 NGS 技術發展至今，已有無數的古老生物被進行定序，這些生物樣品可能來自數千年以前。為了進行定序，首先需要將這些受損或降解的 DNA 片段製備成可供 NGS 定序儀上機使用的 library，而製備的目的主要是讓 DNA 片段兩端接上人工合成的 adapter，一則可起始定序反應，一則可用作 PCR 增輻反應。目前製備的主流方式分為兩種：一種是 454 Life science 使用的 blund end ligation；另一種是 Illumina 使用 Y 型結構的 adapter 進行 A-T ligating，不論何種方式，均為雙股 DNA 的黏合反應，然而，在操作古老 DNA 時，這種製備流程可能會發生一些缺憾。

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